嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白Gn的免疫原性研究.pdf

1、目的:
　　研究SFTSV糖蛋白Gn的體液和細胞免疫原性。
　　方法:
　　1.參考SFTSV HB29病毒株的糖蛋白Gn編碼基因(GenBank:HM745931.1)，優(yōu)化編碼Gn的密碼子，氨基酸序列保持不變?；瘜W合成得到的野生型序列WSP-Gn經(jīng)PCR反應分別在WSP-Gn的5'端和3'端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，在Gn的5'端和3'端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點，然后將上述序列分別克隆到真核表達載

2、體pJW4303，構建重組質粒pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn?；瘜W合成得到的密碼子優(yōu)化型序列WSP-Gn-opt經(jīng)PCR反應分別在Gn-opt的5'端和3'端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點，克隆到pJW4303載體，構建重組質粒pJW4303-tPA-Gn-opt。
　　2.以上述重組質粒和空載體pJW4303分別轉染HEK293T細胞，收集轉染細胞上清和裂解液，Western blot檢測糖蛋白Gn

3、的表達。
　　3.將上述重組質粒及空載體pJW4303以肌肉注射、活體基因導入方式免疫BALB/c小鼠，免疫時間點為第0、2、4、8周，分別在每次免疫前和第6、10周進行內(nèi)眥采血收集血清。通過ELISA法檢測各個時間點小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a水平。
　　4.通過生物信息學方法預測Gn的CTL表位肽，優(yōu)選其中的16條(P1～P16)用Elispot方法篩選并進行后續(xù)研究。按上述方法分別于第0、2、4周免疫B

4、ALB/c小鼠，在第7、17、31、60、90天分批處死小鼠取脾細胞，用Elispot技術檢測分泌IFN-γ的淋巴細胞。
　　結果:
　　1.酶切鑒定和基因測序正確，即成功構建SFTSV糖蛋白Gn表達質粒pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn和pJW4303-tPA-Gn-opt。
　　2.糖蛋白Gn在293T細胞的表達:pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn編碼Gn可在HEK2

5、93T細胞內(nèi)表達;pJW4303-tPA-Gn-opt編碼Gn在HEK293T細胞內(nèi)表達并分泌到細胞外。
　　3.體液免疫應答:pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生抗Gn特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體;pJW4303-tPA-Gn-opt誘導產(chǎn)生的特異性抗體較pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn免疫組出現(xiàn)時間更早、

6、滴度更高，且IgG2a/IgG1接近1，其誘導的Th免疫應答更趨于平衡。
　　4.CTL免疫應答:肽P1、P10能夠刺激重組質粒免疫小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ，且P10相對于P1誘導的CTL免疫應答更強、持續(xù)時間更久;P1刺激組，pJW4303-WSP-Gn誘導的CTL應答較其它兩組為優(yōu)，P10刺激組，pJW4303-tPA-Gn-opt誘導的CTL應答較其它兩組為優(yōu)。
　　結論:
　　1.SFTSV糖蛋白Gn具有良好