人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白基因工程抗體的研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，作為一種新發(fā)的病毒，人們對其感染過程以及引起的機(jī)體免疫反應(yīng)了解較少，SFTSV感染后，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀。在少數(shù)情況下，會引起意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等嚴(yán)重癥狀，并造成休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等多功能臟器衰

2、竭，最終導(dǎo)致死亡。目前，還沒有用于臨床治療的藥物，所以本研究的目的主要是為了制備人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白的基因工程抗體，一方面可以用于病毒感染的臨床檢測，另外一方面也可以用于抗體藥物的制備。
　　本研究利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出具有特異性以及高親和性的單克隆抗體，該技術(shù)在目前科學(xué)研究，疾病診斷以及臨床抗體藥物的制備中都有成功的先例。所謂的噬菌體抗體庫技術(shù)就是將Fab或者scFv抗體基因與噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)

3、基因相互耦聯(lián)，使抗體蛋白融合表達(dá)在噬菌體外殼蛋白的N端，抗體蛋白能夠自發(fā)的折疊而呈天然蛋白狀態(tài)，并且能夠保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于被靶分子識別以及與靶分子結(jié)合，通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”三輪富集過程，可以從噬菌體抗體庫中篩選出特異性針對抗原的單克隆抗體，并且通過各種試驗(yàn)對表達(dá)的抗體進(jìn)行功能鑒定。
　　本研究主要分兩大部分:
　　第一部分:我們分別采用SFTSV-AH12全病毒顆粒和重組表達(dá)SFTSV-Gn蛋白對人

4、源抗SFTSV Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行富集篩選，分別經(jīng)過三輪的“吸附-洗脫-富集”過程，隨機(jī)各挑選了400個克隆，通過ELISA對Fab抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示通過病毒顆粒篩選，我們獲得了364株特異性針對SFTSV核蛋白的陽性克隆，并沒有獲得特異性針對Gn蛋白的陽性克隆;經(jīng)過包被SFTSV-Gn重組蛋白篩選，我們獲得55株與Gn蛋白特異性結(jié)合的陽性克隆，經(jīng)序列分析，總共獲得8株唯一序列的陽性克隆，其中5株來自Lambda庫，

5、3株來自Kappa庫。
　　第二部分:將8株Fab抗體可變區(qū)基因克隆入單質(zhì)粒/哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體HL51-14上，通過PEI轉(zhuǎn)染試劑瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集細(xì)胞上清獲取分泌表達(dá)的IgG全抗體，并使用Protein-A親和層析柱純化IgG抗體，分別采用ELISA、IFA和Western-blotting方法對IgG全抗體進(jìn)行功能鑒定，并通過微量中和試驗(yàn)檢測IgG抗體的中和活性。結(jié)果表明經(jīng)ELISA、IFA和Western-blo

6、tting檢測證實(shí)這8株IgG抗體均能特異性結(jié)合Gn蛋白，且針對的是線性表位，微量中和試驗(yàn)顯示8株新篩抗體沒有表現(xiàn)出中和活性。通過競爭ELISA試驗(yàn)顯示8株IgG抗體與mAb-1C8作用于不同的抗原表位，mAb-1C8已經(jīng)證實(shí)具有中和活性，且結(jié)合的抗原表位是構(gòu)象表位。
　　綜上所述，通過病毒顆粒篩選出大量針對NP的Fab抗體，并沒有篩選得到特異性針對Gn蛋白抗體，表明NP具有強(qiáng)的免疫原性，在SFTSV感染機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用;通