FoxO1磷酸化對CD4+胸腺細胞、Jurkat細胞S1P1表達的影響.pdf

1、背景與目的：
　　T細胞在胸腺經(jīng)歷CD4-CD8-雙陰性、CD4+CD8+雙陽性和CD4+/CD8+單陽性階段而逐漸發(fā)育成熟，單陽性階段的胸腺細胞表達1-磷酸鞘氨醇受體1（Sphingosine-1-phosphate receptor1，S1P1）等分子，在相應(yīng)趨化因子作用下離開胸腺到達外周定居。S1P1是 T細胞遷出胸腺的關(guān)鍵分子，其表達受FoxO1-KLF2-S1P1調(diào)控。FoxO1（forkhead transcripti

2、on factors of the O class1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞核內(nèi)與同源DNA序列結(jié)合促進Kruppel樣因子2（Kruppel-like factor2，KLF2）表達，繼而KLF2影響CCR7、CD62L和S1P1等分子的表達。TCR活化信號能通過PI3K-AKt信號通路使細胞核中FoxO1磷酸化并使其轉(zhuǎn)移至胞漿[1]，同時失去對下游轉(zhuǎn)錄因子KLF2和下游分子S1P1等表達的促進作用，并因而影響胸腺細胞的遷出。我

3、們在前期工作中已報道重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）患者胸腺組織FoxO1、KLF2和S1P1表達均高于對照組，為進一步闡明MG患者胸腺和外周T細胞亞群異常在疾病發(fā)生中的作用，本文對患者CD4+胸腺細胞表達FoxO1及其對下游分子KLF2、CCR7、CD69、S1P1的表達進行了研究?？紤]到患者胸腺細胞的個體差異性以及Jurkat細胞本身的特征，在本研究對來自患者的CD4+胸腺細胞和Jurkat細胞系進行研究，觀察

4、FoxO1磷酸化及去磷酸化對這些細胞下游轉(zhuǎn)錄因子KLF2及S1P1表達的變化。
　　方法：
　　1.研究對象：4例開胸手術(shù)獲得的非自身免疫性先天性心臟病者的正常胸腺組織，經(jīng)過無菌處理并制備胸腺細胞懸液。取出液氮中凍存的Jurkat細胞于37°水浴鍋中快速復(fù)蘇，然后將細胞移至15ml無菌離心管，向其中一滴一滴加入含有10％胎牛血清1640培養(yǎng)液，邊加邊晃，300g4℃離心10min，棄上清，向其中加入含有10%胎牛血清1640

5、培養(yǎng)液5ml，于37°5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，隔天換液、每天顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。然后選取對數(shù)生長期的Jurkat細胞進行試驗。
　　2.免疫磁珠法分選出CD4+胸腺細胞：吸取單個胸腺細胞懸液10μl進行計數(shù)，向1x107個細胞（10μl）加入80μl分選Buffer，再加入20μl CD4單抗，充分混勻后4℃避光孵育15min，再加入2ml Buffer混勻，300g4℃離心10min，棄上清，向其中加入500

6、μl Buffer反復(fù)吹打使細胞重懸，然后再將MS柱子放入磁力架中，加入0.5ml PBE潤細，在重力作用下自然流盡,反復(fù)洗滌后將分離柱移出磁場，加入Buffer并收集，即得到CD4+胸腺細胞。
　　3. FoxO1磷酸化和去磷酸化試驗：分別將CD4+SP胸腺細胞和Jurkat細胞分成三組，第一組為FoxO1磷酸化組。以5μg/ml CD3單抗的包被液將6孔板進行包被，4℃冰箱過夜處理，棄去包被液，加入含1μg/ml CD28單抗

7、和10%胎牛血清的濃度為2×106個/ ml細胞懸液2ml；第二組為FoxO1去磷酸化組。在2×106個/ ml細胞懸液加入PI3K-AKT信號通路特異性抑制劑LY29400212.5μg/ml；第三組為對照組（control）。以含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)液孵育；放于37°5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育48h，收集細胞。
　　4. FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA的表達：分別提取各組細胞總RNA，采

8、用熒光定量PCR法檢測FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA的表達水平，采用2-△△Ct法分析FoxO1磷酸化組、FoxO1去磷酸化組與對照組比較各基因的相對表達差異。
　　5. FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白的表達情況：分別提取各組細胞的總蛋白，通過Western blot定量法檢測比較FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白水平，分析其蛋白表達差異。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析

9、數(shù)據(jù)統(tǒng)計均用均數(shù)±標準差來分析，應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析數(shù)據(jù)。2組樣本之間的比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism5.0進行分析。結(jié)果以P＜0.05被視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. CD3和CD28單抗對CD4+SP胸腺細胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達的影響：Real-Time PCR檢測各組FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的

10、變化。結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平與空白對照組相比均顯著降低（P＜0.05）。而CD69 mRNA水平與空白對照組相比發(fā)生顯著增高（P＜0.05）。
　　2. PI3K-AKt信號通路特異性抑制劑LY294002對CD4+SP胸腺細胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達的影響：Real-Time PCR檢測各組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69

11、 mRNA水平的變化。分析結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1去磷酸化組FoxO1 mRNA水平與空白對照組相比顯著升高（P＜0.05），而KLF2、S1P1 mRNA水平與空白對照組相比均發(fā)生顯著降低（P＜0.05），而CCR7、CD69 mRNA水平與空白對照組相比均發(fā)生顯著降低（P＞0.05）。
　　3. CD3和CD28對Jurkat細胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達的影響：Real-Time PCR檢測分別處理3

12、h、6h、12h、24h、48h各組的FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的變化。CD3和CD28處理48h后的結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平空白對照組相比均發(fā)生顯著降低（P＜0.05）。CD69 mRNA水平空白對照組相比發(fā)生顯著增高（P＜0.05）。
　　4. PI3K-AKt信號通路特異性抑制劑LY294002對Jurkat細胞FoxO1、KLF

13、2、S1P1及CCR7、CD69表達的影響：Real-Time PCR檢測分別處理3h、6h、12h、24h、48h各組的FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA水平的變化。LY294002處理48h后的結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1去磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1 mRNA水平與空白對照組相比均顯著升高（P＜0.05），而CD69 mRNA水平與空白對照組相比顯著升高（P＞0.05），CCR7 mRNA水平與空白對照

14、組相比顯著降低（P＞0.05）。
　　5. FoxO1磷酸化和FoxO1去磷酸化對Jurkat細胞P-FoxO1、FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表達的影響：CD3和 CD28聯(lián)合處理48h后的 FoxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表達水平與空白對照組比較顯著降低（P＜0.05）， P-FoxO1蛋白表達水平與空白對照組比較顯著升高（P＜0.05）。PI3K-AKt信號通路特異性抑制劑LY294002處理48h的