TSC1和TSC2蛋白的表達(dá)、純化和性質(zhì)探討.pdf

1、結(jié)節(jié)性硬化癥（Tuberous Sclerosis Complex，TSC）是一種在多器官發(fā)生良性腫瘤的常染色體顯性疾病。該疾病表現(xiàn)出多種臨床病癥，如癲癇、自閉癥、腎血管平滑肌瘤等。結(jié)節(jié)性硬化癥由腫瘤抑制基因TSC1和TSC2發(fā)生突變所致，不同突變導(dǎo)致的病癥和嚴(yán)重程度都不同。這兩個(gè)基因分別編碼的TSC1和TSC2蛋白形成 TSC1/2復(fù)合物，在mTOR信號(hào)通路中起到負(fù)調(diào)控的作用。TSC1/2復(fù)合能夠整合上游的氨基酸、生長因子、能量、低氧

2、和細(xì)胞因子等生長信號(hào)，轉(zhuǎn)化為 TSC1和TSC2不同位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)。TSC2的GTP酶激活蛋白（GAP）結(jié)構(gòu)域活化Rheb（Ras homolog enriched in brain GTPase），從而抑制mTORC1（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1，mammalian target of rapamycin complex1）的活性，降低細(xì)胞的合成代謝水平。該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)學(xué)研究有助于揭示其調(diào)控機(jī)理。
　　本研究表達(dá)和純化人和

3、裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）的TSC1和TSC2蛋白，進(jìn)行結(jié)晶嘗試。我們利用大腸桿菌Escherichia coli（E. coli）表達(dá)TSC1的coiled coil結(jié)構(gòu)域和TSC2的GAP結(jié)構(gòu)域，裂殖酵母TSC1540-675 aa的MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）融合蛋白表達(dá)較好，但聚合度高；TSC2完整的GAP結(jié)構(gòu)域沉淀，人TSC21516-1708 aa可溶，但與人Rheb共點(diǎn)晶不

4、結(jié)晶。用昆蟲細(xì)胞Sf9共表達(dá)裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白，TSC1全長（TSC1 FL）和TSC2全長（TSC2 FL）表達(dá)量低；TSC1的C端截短，如1-799 aa、1-718 aa表達(dá)量較高；TSC2的C端截短表達(dá)量不如TSC2 FL；Anti-Flag親和純化Flag-TSC2同時(shí)拉出His-TSC1，可得到純度高的TSC1/2復(fù)合物，解決了TSC1表達(dá)量高于TSC2的問題；TSC1需要一定長度的coiled coil來穩(wěn)定T

5、SC2，部分C端截短的TSC11-718 aa或1-799 aa和TSC2 FL共表達(dá)有利于提高TSC2的表達(dá)量。裂殖酵母TSC1以二聚體的形式存在；TSC1結(jié)合TSC2，TSC1/2復(fù)合物會(huì)聚合成分子量大于1 MDa的多聚體；TSC2的N端和GAP結(jié)構(gòu)域可以分開，TSC1和TSC2的N端結(jié)合。Expi293F表達(dá)系統(tǒng)適合人TSC1 FL和TSC2 FL的表達(dá)，但表達(dá)量較低，截短蛋白的表達(dá)情況不如全長?？傊?，本研究對(duì) TSC1和TSC2