HLA-DRB1-0803轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及表達(dá)功能的研究.pdf

1、目的:
　　由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致的乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，不僅在世界范圍內(nèi)感染人數(shù)眾多，而且容易發(fā)展成為肝硬化和肝癌。雖然乙肝疫苗的成功應(yīng)用使新發(fā)的HBV感染數(shù)量有所下降，但目前全世界仍有3.5億慢性乙肝病毒感染者，核苷類似物和干擾素或許可以使部分患者的血清學(xué)指標(biāo)轉(zhuǎn)陰，但不能徹底清除肝細(xì)胞內(nèi)部的病毒。相對于HCV和其他一些嗜肝病毒來說，目前人們還沒有找到一種可以徹底治愈HBV感染的辦法。
　　為了

2、研究HBV的感染致病機(jī)制和研發(fā)防治藥物，人們迫切需要構(gòu)建一個合適的動物模型，但由于HBV有明顯的嗜肝性，且宿主范圍狹窄，體外培養(yǎng)困難，使HBV動物模型的選擇方面受到了很大限制。近年來，人們嘗試建立了多種HBV動物模型，如大鼠、樹鼩、人-小鼠嵌合肝模型等，但均有各自的不足，其中一個共同的缺點(diǎn)即是，無法模擬人體對HBV感染產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。
　　人類白細(xì)胞抗原(HLA)的高度多態(tài)性是造成宿主感染HBV的結(jié)局異同的主要原因。前期的G

3、WAS研究結(jié)果表明，HLA的DRB1*0803等位可能在慢性乙型肝炎的感染過程中起到了保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究HLA-DRB1*0803的保護(hù)效應(yīng)及遺傳免疫學(xué)機(jī)制，擬構(gòu)建HLA-DRB1*0803轉(zhuǎn)基因人源化免疫小鼠模型。
　　本研究構(gòu)建了包含小鼠MHC-Ⅱ類分子組織特異性表達(dá)調(diào)控元件的HLA-DRB1*0803轉(zhuǎn)基因載體，并在體外和體內(nèi)分別進(jìn)行了表達(dá)功能驗證和轉(zhuǎn)基因鼠模型構(gòu)建。
　　方法:
　　提取WATANABE細(xì)

4、胞（基因型為DRB1*0803純合子）的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴(kuò)增出DRB1*0803基因片段。在NCBI上查找到小鼠Eα promoter和兔β-globin的基因序列，用重疊PCR的方法化學(xué)合成。將上述3段基因按順序連接到pBR002-1acz載體上。測序驗證無誤后，成功構(gòu)建表達(dá)載體HLA-DRB1*0803。使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒將該載體轉(zhuǎn)染至小鼠DCS細(xì)胞和B細(xì)胞系，用WesternBlo

5、t和免疫熒光的方法對目的蛋白進(jìn)行檢測。用T細(xì)胞增殖的方法檢測該載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞是否可以將抗原遞呈給人的T細(xì)胞，啟動MHC-Ⅱ類限制性的CD4+ Th1反應(yīng)。用XbaⅠ內(nèi)切酶切開質(zhì)粒環(huán)，將含有目的基因的片段采用顯微注射的方法注射入FVB/N品系小鼠的受精卵內(nèi)，制備F0代DRB1*0803轉(zhuǎn)基因小鼠，剪尾提取DNA后用PCR的方法進(jìn)行篩選。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)全自動序列分析儀測序驗證，成功擴(kuò)增、克隆了人類HLA-DRB1*0

6、803基因，構(gòu)建了HLA-DRB1*0803表達(dá)載體。
　　2.經(jīng)HLA-DRB1*0803轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染后，小鼠DCS細(xì)胞和B細(xì)胞系的WesternBlot分析結(jié)果均表達(dá)出了大小約為29KDa的目的蛋白。
　　3.免疫熒光結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后DCS細(xì)胞的胞漿和胞膜上可見特異性蛋白表達(dá)。
　　4.T細(xì)胞增殖實驗表明，轉(zhuǎn)染后的小鼠DCS細(xì)胞可將負(fù)載的HBcAg遞呈給人的T細(xì)胞，產(chǎn)生特異的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　5.篩選出