NF-κB抑制劑倍半萜內(nèi)酯對(duì)糖尿病小鼠腎組織胰島素抵抗改善的分子機(jī)制初探.pdf

1、背景:糖尿病腎病(DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前仍以較晚期的降壓、降糖治療為主，缺乏針對(duì)其早期發(fā)病機(jī)制的深入研究及干預(yù)措施。目前針對(duì)糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在多元醇及蛋白激酶C通路激活，糖基化終末產(chǎn)物累積以及炎癥信號(hào)通路活化等方面。而這些因素與胰島素抵抗(insulinresistance，IR)密不可分。但目前關(guān)于IR在糖尿病腎病中的具體表現(xiàn)形式及針對(duì)IR干預(yù)措施的研究相對(duì)較少。AS160是一種Rab-GTP酶活化蛋白，可以

2、調(diào)控包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體在內(nèi)的多種物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位過(guò)程。在腎臟，AS160被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控鈉、水通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，但對(duì)于腎臟糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控未見(jiàn)報(bào)道。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)是介導(dǎo)胰島素刺激的糖攝取的主要糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，是胰島素信號(hào)通路的重要效應(yīng)器，與IR密切相關(guān)。在經(jīng)典胰島素敏感組織如骨骼肌和脂肪細(xì)胞中，AS160被發(fā)現(xiàn)是糖代謝胰島素信號(hào)通路中GLUT4的上游分子，其磷酸化形式可促進(jìn)GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，與GLUT4的功能密不可分。研

3、究已表明，條件性敲除骨骼肌或脂肪細(xì)胞GLUT4及AS160可導(dǎo)致全身和局部組織的IR。近端腎小管上皮細(xì)胞鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(SGLT1)和鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(SGLT2)通過(guò)重吸收葡萄糖對(duì)維持機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)有重要作用，已成為新型降糖藥物的靶點(diǎn)。因此，針對(duì)糖尿病腎組織中AS160與糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4及SGLT1/SGLT2的研究有助于探索腎臟IR的分子機(jī)制，以期為早期干預(yù)糖尿病腎損害和改善DN預(yù)后提供可能的分子靶點(diǎn)。我們前期研究結(jié)果顯示，NF-κ

4、B抑制劑倍半萜內(nèi)酯(PTN)可以改善糖尿病小鼠全身IR及腎臟病理?yè)p傷，其是否對(duì)腎臟IR有作用及可能的機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:在db/db糖尿病腎病小鼠基礎(chǔ)上研究糖尿病腎組織是否存在AS160與糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4及SGLT1/SGLT2導(dǎo)致的胰島素抵抗。了解NF-κB抑制劑PTN是否可以改善糖尿病腎組織IR，進(jìn)而延緩DN進(jìn)展。
　　方法:建立db/db糖尿病腎病小鼠模型并設(shè)立PTN干預(yù)組。將小鼠分為三組:對(duì)照組(db/m+

5、NS)、糖尿病腎病組(db/db+NS)、PTN干預(yù)組(db/db+PTN)。所有小鼠在8周齡開(kāi)始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，分別在處理的T0（8周齡）、T4（12周齡）、T8（16周齡）及T12（20周齡）留取血清、尿液及腎組織標(biāo)本。利用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫組化/熒光、免疫印跡(WB)等方法檢測(cè)小鼠AS160、p-AS160(Thr642)及糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT4、SGLT1/SGLT2在糖尿病腎組織中的表達(dá)情況;對(duì)AS160/p-AS160與GLUT4、

6、SGLT1/SGLT2進(jìn)行共定位，初步探索AS160對(duì)腎臟糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控情況，了解AS160在糖尿病腎組織胰島素抵抗中的作用。
　　結(jié)果:
　　(1) db/db小鼠糖尿病腎病模型建立成功。自8周齡起，db/db小鼠體重即高于db/m小鼠。隨著周齡增加，db/db小鼠表現(xiàn)出尿蛋白增加，高血脂、高血糖、高胰島素血癥，以及腎小球肥大、系膜基質(zhì)增多等生化和腎臟病理改變。
　　(2)免疫組化和免疫熒光顯示AS160在腎臟有表達(dá)

7、，主要表達(dá)在腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管中，在腎小球的鮑曼氏囊上皮細(xì)胞側(cè)可見(jiàn)較弱的表達(dá)。AS160蛋白在db/m小鼠腎臟的表達(dá)不隨周齡增加而改變。而在db/db小鼠，AS160蛋白表達(dá)較db/m小鼠輕度增加。給予PTN干預(yù)后，兩組并無(wú)明顯差別。免疫組化測(cè)定db/db小鼠AS160蛋白水平表達(dá):8w1.22±0.26，12w1.27±0.38，16w1.35±0.25，20w1.22±0.30。給予PTN干預(yù)0周、4周、8周及12周后AS160

8、蛋白表達(dá)為T0(8w)1.17±0.22, T4(12w)1.22±0.31, T8(16w)1.24±0.39, T12(20w)1.03±0.35。
　　(3)免疫熒光顯示p-AS160(phospho T642)主要分布在腎皮質(zhì)小管的管腔側(cè)，在髓質(zhì)腎小管的表達(dá)較弱，而在腎小球未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。腎臟中p-AS160蛋白表達(dá)在db/db小鼠早期(8w)高于db/m小鼠，但隨著周齡的增加，其表達(dá)呈下降趨勢(shì)。給予db/db小鼠PTN干預(yù)

9、后，p-AS160的下降趨勢(shì)有所改善。免疫組化顯示db/db小鼠腎臟p-AS160表達(dá)為:8w1.55±0.30，12w1.18±0.22，16w1.06±0.20，20w0.98±0.18。給予PTN干預(yù)0周、4周、8周及12周后p-AS160表達(dá)為T0(8w)1.54±0.32, T4(12w)1.42±0.26, T8(16w)1.41±0.21, T12(20w)1.34±0.08。
　　(4)免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示G

10、LUT4同樣以腎小管為主要表達(dá)部位，皮質(zhì)和髓質(zhì)腎小管均有表達(dá)，腎小球未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。GLUT4在db/m小鼠腎臟表達(dá)不隨周齡增加而改變;但在db/db小鼠，GLUT4無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白水平，均表現(xiàn)出早期（8周齡）升高，隨著周齡的增加，表達(dá)逐漸降低的趨勢(shì)。而PTN可以增加DN小鼠腎臟GLUT4的表達(dá)。GLUT4 mRNA與GLUT4蛋白在不同周齡db/db小鼠腎臟表達(dá)情況分別為:GLUT4mRNA水平8w1.79±0.25，12

11、w1.32±0.33，16w0.98±0.23，20w1.00±0.12;GLUT4蛋白水平8w1.32±0.28，12w1.05±0.47，16w0.85±0.10，20w0.88±0.25。PTN干預(yù)db/db小鼠0周(T0)、4周(T4)、8周(T8)及12周(T12)后GLUT4蛋白表達(dá)分別為T0(8w)1.31±0.21，T4(12w)1.20±0.39, T8(16w)1.42±0.43, T12(20w)1.53±0.15

12、。
　　(5)免疫熒光共染顯示AS160及p-AS160((phospho T642)均與部分GLUT4在腎小管上皮細(xì)胞有共表達(dá)。雖然SGLT1/SGLT2主要表達(dá)在近端腎小管管腔側(cè)，但p-AS160與SGLT1僅有少量的共表達(dá)，與SGLT2在腎小管上皮細(xì)胞無(wú)共表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　(1)db/db糖尿病腎病小鼠模型具有全身胰島素抵抗的特點(diǎn)，并伴有糖尿病腎病病理改變。給予PTN干預(yù)后可改善其全身全身胰島素抵抗情況及腎

13、臟病理變化。
　　(2)AS160及其功能形式p-AS160在腎臟有表達(dá)，以腎小管為主要表達(dá)部位。隨著DN小鼠周齡增加，p-AS160糖尿病腎組織的表達(dá)逐漸降低。
　　(3)GLUT4在小鼠腎臟主要表達(dá)腎小管中，其在db/db小鼠腎臟表達(dá)呈降低趨勢(shì)。部分GLUT4與AS160及P-AS160在腎小管上皮細(xì)胞有共表達(dá)，提示腎臟可能存在AS160調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　(4)給予PTN干預(yù)后，糖尿病腎組織p-A

14、S160與GLUT4表達(dá)增加，提示PTN可能通過(guò)增加糖轉(zhuǎn)運(yùn)，改善糖尿病腎組織糖代謝及胰島素敏感性。
　　(5)SGLT1/SGLT21與p-AS160(Thr642)無(wú)明顯共表達(dá)，考慮AS160并不參與SGLT1/SGLT2的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控或不是其主要調(diào)控蛋白。
　　目的:準(zhǔn)確評(píng)價(jià)兒童腎功能對(duì)兒童腎臟疾病早期診斷、早期治療具有重要意義。中國(guó)成人估算腎小球?yàn)V過(guò)率公式(eGFR)在臨床上的應(yīng)用相對(duì)成熟，而國(guó)外兒童GFR估算公式在我國(guó)兒

15、童人群中的應(yīng)用并未得到驗(yàn)證。目前我國(guó)關(guān)于兒童GFR測(cè)定方法的研究較少，我國(guó)仍缺乏一種準(zhǔn)確評(píng)價(jià)兒童腎功能的方法。碘海醇血漿清除率已被證實(shí)是測(cè)定腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的可靠方法，然而該方法在中國(guó)尚未被廣泛應(yīng)用及推廣。本課題前期工作已建立利用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定血清碘海醇濃度的方法，該方法穩(wěn)定可靠。本研究擬在慢性腎臟病兒童中以9mTc-DTPA血漿清除率為參照評(píng)價(jià)碘海醇清除率評(píng)估兒童腎小球?yàn)V過(guò)率的準(zhǔn)確性;評(píng)估單次采血法和干血濾紙片法

16、在碘海醇清除率應(yīng)用中的可行性。
　　方法:設(shè)定HPLC色譜條件，建立碘海醇血清濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、方法的精密度、真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證。納入慢性腎臟病兒童33例（前期工作已納入12例，總共45例），同時(shí)進(jìn)行91c-DTPA清除率與碘海醇血漿清除率測(cè)定，即分別在99mTc-DTPA和碘海醇注射后2h和4h以及2h和5h進(jìn)行兩次采血，測(cè)量99mTc-DTPA和碘海醇血漿清除率。評(píng)價(jià)兩種方法測(cè)得的腎小球?yàn)V過(guò)率的相關(guān)性和一致性。

17、對(duì)碘海醇單次采血法(2h)與碘海醇雙次采血法(2h和5h)進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)單次采血的可行性。對(duì)13例患兒同時(shí)采用干血濾紙片法測(cè)定碘海醇清除率，并與碘海醇雙次采血法進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)干血斑濾紙片碘海醇清除率可行性。
　　結(jié)果:
　　(1)本研究建立的HPLC法測(cè)定碘海醇濃度在10～1000mg/L范圍內(nèi)線性良好(R2=0.9998)，該方法的精密度、真實(shí)性較好（批間誤差與批內(nèi)誤差RSD％＜5％，平均回收率R％＞96％）。
　　

18、(2)45例患兒均完成碘海醇血漿清除率測(cè)定。其中36例患兒同時(shí)完成99mTc-DTPA血漿清除率測(cè)定，13例患兒完成千血濾紙片碘海醇清除率測(cè)定。
　　(3)碘海醇血漿清除率與99mTc-DTPA血漿清除率比較，兩者有很好的相關(guān)性（r=0.941,P＜0.01)，兩者結(jié)果的差值較小，為(6.53±11.6) ml/(min.1.73m2)。
　　(4)單次采血與雙次采血測(cè)得的碘海醇清除率相關(guān)性為r=0.958，差值為(4.26