無義突變的F9和MEN1基因的翻譯調(diào)控及基因通讀研究.pdf

1、由于遺傳或者是獲得性的原因，在基因正常終止密碼子的上游產(chǎn)生了一個終止密碼子，稱為早發(fā)性無義突變（PTC）。大約有三分之一的人類疾病是由于早發(fā)性無義突變引發(fā)的，其中主要包括遺傳性疾病和癌癥類疾病，本文主要針對的兩種疾病：血友病B是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性疾病，是由編碼凝血因子IX基因（F9）突變導(dǎo)致的先天性凝血機制障礙疾病，根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，早發(fā)性無義突變占F9基因突變中的11.1％；多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病I型（MEN1）是一種常染色

2、體顯性遺傳癌癥類疾病，作為抑癌基因的MEN1，其上80%的突變是無義突變或是移碼突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　早發(fā)性無義突變引發(fā)的疾病在傳統(tǒng)的治療上以替代療法、手術(shù)、放療和化療為主，翻譯通讀治療（TBT）在近年來逐步成為治療早發(fā)性無義突變疾病的主要策略之一，翻譯通讀治療以促通讀藥物作用于早發(fā)性無義突變位點，使帶有PTC的基因發(fā)生通讀效應(yīng)，表達出全長的具有功能的蛋白。
　　氨基糖苷類藥物（G418等）和非氨基糖苷類藥物（PTC1

3、24等），作為促通讀藥物，在 PTC引發(fā)疾病的治療中具有一定的療效，但是不同患者的療效差異很大，影響通讀效率的因素有很多：促通讀藥物的選擇、PTC所在基因位置的上下文結(jié)構(gòu)以及無義突變介導(dǎo)的mRNA降解途徑（NMD），這些影響因素的檢測和考量是個體化治療的前提和基礎(chǔ)。另外，大量促通讀候選藥物亦需要高通量的篩選體系來完成篩選過程。
　　首先，本研究針對促通讀藥物的研究需求，利用綠色熒光蛋白（EGFP）基因和紅色熒光蛋白（DsRed）基

4、因構(gòu)建早發(fā)性無義突變雙熒光篩選體系，該體系包括雙熒光哺乳動物表達載體 pDsRed-EGFPmtag-及其早發(fā)性無義突變體pDsRed-EGFPmtag-Y445X，該體系轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞COS7后，載體能夠進行正確的表達，并且能被流式細胞儀檢出。轉(zhuǎn)染早發(fā)性無義突變體 pDsRed-EGFP mtag-Y445X的細胞經(jīng)促通讀藥物PTC124處理，通過流式細胞儀測定熒光蛋白的平均熒光強度，可以精確得出促通讀藥物的通讀效率，而且發(fā)現(xiàn)PTC

5、124的促通讀效果與作用濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨后實時熒光定量PCR反應(yīng)對目標基因EGFP的mRNA的定量檢測，同樣證實了PTC124具有劑量依賴性的促通讀活性。通過以上實驗，說明該篩選體系克服了現(xiàn)行熒光素酶表達體系熒光素底物假陽性的缺點，能夠快速準確的反映藥物促通讀活性。
　　該載體采用雙熒光報告基因系統(tǒng)，以DsRed紅色熒光作為內(nèi)標，排除了共轉(zhuǎn)染等操作步驟帶來的系統(tǒng)誤差，可以精確計算PTC的通讀效率；該載體預(yù)留的多克隆位點，

6、可以插入帶有PTC及其上下文結(jié)構(gòu)的基因片段，最大程度的模仿促通讀藥物作用的細胞環(huán)境，對通讀藥物的效果做出精確的測量。
　　其次，本研究以遺傳性疾病血友病B的F9基因為研究對象，將F9基因的編碼序列導(dǎo)入雙熒光哺乳動物表達載體 pDsRed-EGFPmtag-，構(gòu)建了表達載體pDsRed-F9-EGFPmtag-，并根據(jù)血友病數(shù)據(jù)庫中登記的點突變構(gòu)建了該載體的3個無義突變體Y22X、E258X和E296X。突變體轉(zhuǎn)染細胞COS7后，氨

7、基糖苷類藥物G418和非氨基糖苷類藥物PTC124分別處理細胞，流式細胞儀檢測和qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PTC124的促通讀效果要優(yōu)于G418，利用凝血因子IX促凝活性檢測試劑盒測試部分支持上述結(jié)果。
　　再次，本研究以癌癥類疾病多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病I型的MEN1基因為研究對象，在本小組的研究中發(fā)現(xiàn)，通過構(gòu)建MEN1基因的小基因，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，促通讀藥物作用后，MEN1基因由于其上的PTC而受到NMD途徑調(diào)控，促通讀藥物PTC12

8、4能提高menin全長蛋白的表達量，但是得到的menin全長蛋白功能恢復(fù)情況得不到確切的反映。本研究以干擾質(zhì)粒pSIR-MEN1-10轉(zhuǎn)染Hela細胞，干擾MEN1表達， qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MEN1的效應(yīng)基因Caspase8伴隨MEN1的敲減而下調(diào)，流式細胞儀檢測減緩了細胞的凋亡，為PTC124的促通讀效果給出了功能水平上的直接證據(jù)。
　　最后，本研究擴展了無義突變促通讀藥物雙熒光篩選體系的應(yīng)用范圍：構(gòu)建了帶有雙標簽（HA t

9、ag和c-Myc tag）的凝血因子IX小基因II（Mini-hF9-II gene），該小基因由三部分組成：外顯子1-7+內(nèi)含子7＋外顯子8。構(gòu)建了含有Mini-hF9-II基因的重組表達質(zhì)粒 pCMV-3B-Mini-hF9-II，并將其轉(zhuǎn)染到細胞中，通過 RT-PCR及Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，小基因可以正確剪切、拼接和表達全長蛋白。導(dǎo)入篩選體系后，將能從EJC模型的角度考查NMD途徑對促通讀藥物的影響；本文分離并通過細胞

10、形態(tài)學(xué)、表面抗原以及多向分化能力等方法鑒定了間充質(zhì)干細胞（MSCs），并且將雙熒光篩選體系初步轉(zhuǎn)染了間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強的分化潛能，外源基因易于植入間充質(zhì)干細胞，并且植入的基因易于在間充質(zhì)干細胞內(nèi)穩(wěn)定的表達而不影響其特性，對于間充質(zhì)干細胞而言，植入外源基因引發(fā)的損傷小，反應(yīng)弱，將此雙熒光篩選體系和間充質(zhì)干細胞結(jié)合起來，為構(gòu)建促通讀藥物篩選的間充質(zhì)干細胞模型，更為下一步促通讀藥物篩選的動物模型體內(nèi)