SDF-1-IGF-1緩釋溫敏型水凝膠修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究.pdf

1、背景：
　　關(guān)節(jié)軟骨病變作為一個(gè)基本的病理過(guò)程，幾乎參與了所有臨床常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病病理變化早期階段。由于軟骨組織內(nèi)缺乏血管和淋巴分布，軟骨細(xì)胞含量少，缺少細(xì)胞分化所必須的祖母細(xì)胞且包埋于稠厚的細(xì)胞外基質(zhì)中，遷徙難度大，無(wú)法有效移動(dòng)到損傷部位參與修復(fù)，因此其自我修復(fù)能力非常差，即使是微小的軟骨缺損也難以自然修復(fù)。目前臨床上對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨損傷主要以手術(shù)治療為主，包括:關(guān)節(jié)鏡修復(fù)術(shù)、微骨折術(shù)、自體軟骨移植術(shù)和自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等。然而這些治

2、療方法臨床療效不夠理想，且存在許多不足之處。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)，為關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供了一種全新的思路和方法。軟骨組織工程的研究?jī)?nèi)容主要包括三個(gè)方面:種子細(xì)胞、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和支架材料。其中支架材料為種子細(xì)胞提供獲取營(yíng)養(yǎng)、氣體交換、廢物排泄和生長(zhǎng)代謝的場(chǎng)所，種子細(xì)胞附著于支架材料上不斷更新、代謝，分化繁殖新的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)因子參與調(diào)控種子細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等，最終形成與正常軟骨組織在形態(tài)和功能上完全一致且能正常代謝、增殖的新生

3、軟骨組織。
　　脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)具有以下優(yōu)點(diǎn):1.取材方便，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少，病人易于接受;2.分離培養(yǎng)簡(jiǎn)單，容易獲得;3.獲取效率高，每1g脂肪組織可以獲得5×103干細(xì)胞，是1g骨髓組織獲得干細(xì)胞的300倍，非常適合作為種子細(xì)胞。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)與軟骨發(fā)育和再生關(guān)系密切，在ADSCs定向分化

4、為軟骨細(xì)胞的過(guò)程中起到了非常關(guān)鍵的作用，它能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、再分化，保持軟骨細(xì)胞的特異表型并抑制程序性凋亡，同時(shí)促進(jìn)軟骨基質(zhì)合成代謝，抑制軟骨基質(zhì)的降解，是體內(nèi)調(diào)節(jié)軟骨蛋白聚糖合成最重要的生長(zhǎng)因子?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)又被稱為“歸巢趨化因子”，在啟動(dòng)和促進(jìn)干細(xì)胞歸巢方面具有重要的作用。溫敏型水凝膠具有微創(chuàng)可注射性，無(wú)毒性，良好的生物相容性，高含水量和高親水性，

5、注射入體內(nèi)后能夠在體溫下快速的原位轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀，而且能為種子細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)環(huán)境。
　　本實(shí)驗(yàn)制備了載IGF-1 PLGA緩釋微球和PLGA-PEG-PLGA溫敏型水凝膠，研究了其理化性能及對(duì)體外培養(yǎng)的ADSCs的增殖與分化的促進(jìn)作用，并聯(lián)合ADSCs和SDF-1構(gòu)建了水凝膠復(fù)合體，觀察其對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果。從而為其將來(lái)的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題主要分三部分:(1)采用W/O/W乳化-溶劑揮發(fā)法制備IGF-1 PLG

6、A微球，采用開(kāi)環(huán)聚合法制備PLGA-PEG-PLGA水凝膠，掃描電鏡對(duì)PLGA微球、水凝膠及載微球水凝膠進(jìn)行形貌觀察，檢測(cè)其載藥量和包封率，繪制藥物釋放曲線，并對(duì)水凝膠進(jìn)行膠凝化觀察;(2)分離培養(yǎng)兔ADSCs，觀察IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體對(duì)其增殖過(guò)程的影響及對(duì)其軟骨方向分化的作用;(3)以IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體作為載體搭載ADSC

7、s，將其植入兔股骨髁軟骨缺損處，觀察研究其修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。
　　第一部分 IGF-1 PLGA緩釋微球和PLGA-PEG-PLGA溫敏型水凝膠的制備
　　目的觀察分別采用W/O/W乳化-溶劑揮發(fā)法和開(kāi)環(huán)聚合法能否成功制備適合軟骨組織工程研究用的IGF-1 PLGA微球和PLGA-PEG-PLGA水凝膠。
　　方法采用W/O/W乳化-溶劑揮發(fā)法制備IGF-1 PLGA微球，采用開(kāi)環(huán)聚合法制備PLGA-PEG-P

8、LGA水凝膠，并制備其復(fù)合體。檢測(cè)IGF-1 PLGA微球的載藥量和包封率，觀測(cè)PLGA-PEG-PLGA水凝膠的溫敏性質(zhì)，分別觀察IGF-1與SDF-1的體外釋放性質(zhì)，透射電鏡及掃描電鏡觀察各自的形貌特征，以及觀察水凝膠復(fù)合體的膠凝化性能。
　　結(jié)果成功制備IGF-1 PLGA微球，PLGA-PEG-PLGA水凝膠及其復(fù)合體。檢測(cè)IGF-1PLGA微球的載藥量平均值為0.0622％，包封率平均值為81.8％。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的P

9、LGA-PEG-PLGA水凝膠膠凝溫度為33.2±0.1℃。復(fù)合體中IGF-1和SDF-1在第1天的突釋率分別為14.4％和27.7％。透射電鏡和掃描電鏡顯示PLGA微球直徑大小為50-80μm，在水凝膠中形態(tài)保持良好。水凝膠復(fù)合體在37℃時(shí)3分鐘即可膠凝化。
　　結(jié)論我們制備的IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體膠凝性質(zhì)良好，能夠持續(xù)緩釋SDF-1和IGF-1雙生長(zhǎng)因子，能夠滿足軟骨組織工

10、程研究的需要。
　　第二部分 IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體對(duì)兔ADSCs增殖、分化的影響
　　目的研究IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體對(duì)體外培養(yǎng)的兔ADSCs增殖過(guò)程的影響及對(duì)其軟骨方向分化的作用。
　　方法取兔腹股溝部脂肪組織分離培養(yǎng)ADSCs并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。使用第3代ADSCs，分別觀察其成骨誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)分

11、化能力。MTT法檢測(cè)IGF-1PLGA微球、載SDF-1 PLGA-PEG-PLGA水凝膠及其復(fù)合體對(duì)兔ADSCs增殖的影響。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)它們對(duì)ADSCs SOX-9、CollagenⅡ和Aggrecan基因表達(dá)的影響。Western Blot檢測(cè)它們對(duì)ADSCs SOX-9、CollagenⅡ和Aggrecan等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果分離培養(yǎng)的ADSCs的成骨誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)分化均成功。PLGA微球和PL

12、GA-PEG-PLGA水凝膠對(duì)兔ADSCs的細(xì)胞活性和增殖無(wú)不良影響，IGF-1PLGA微球和水凝膠復(fù)合體在第3、7天對(duì)ADSCs具有較為明顯的增殖促進(jìn)作用。與IGF-1 PLGA微球和水凝膠復(fù)合體共培養(yǎng)的ADSCs在培養(yǎng)第7、14天時(shí)SOX-9、CollagenⅡ和Aggrecan基因表達(dá)顯著增高，各組蛋白表達(dá)結(jié)果與PCR結(jié)果一致。
　　結(jié)論我們制備的IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體不

13、僅是一個(gè)良好的載藥系統(tǒng)，其三維立體結(jié)構(gòu)及高含水性還能為種子細(xì)胞提供優(yōu)良的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)ADSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化促進(jìn)作用明顯，在軟骨組織工程中將有廣闊的應(yīng)用前景。
　　第三部分 ADSCs/IGF-1緩釋微球/SDF-1/溫敏型水凝膠修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的研究
　　目的以IGF-1 PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝膠復(fù)合體作為載體搭載ADSCs，將其植入兔股骨髁軟骨缺損處，觀察研究其對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的

14、修復(fù)作用。
　　方法將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5組:對(duì)照組:手術(shù)造成股骨髁軟骨缺損，不做任何處理;hydrogel+MS組:兔股骨髁軟骨缺損處植入已膠凝化的，含10mg/mlIGF-1 PLGA微球的PLGA-PEG-PLGA水凝膠，不加SDF-1;hydrogel+SDF-1組:兔股骨髁軟骨缺損處植入已膠凝化的，含0.5μg/ml SDF-1的PLGA-PEG-PLGA水凝膠，不加IGF-1 PLGA微球;hydrogel+M

15、S+SDF-1組:兔股骨髁軟骨缺損處植入已膠凝化的，含10mg/ml IGF-1 PLGA微球和0.5μg/ml SDF-1的PLGA-PEG-PLGA水凝膠;hydrogel+MS+SDF-1+ADSCs組:兔股骨髁軟骨缺損處植入已膠凝化的，含10mg/mlIGF-1 PLGA微球，0.5μg/ml SDF-1及1×106/ml ADSCs的PLGA-PEG-PLGA水凝膠。分別于術(shù)后第6周和第12周收集標(biāo)本，分別對(duì)其進(jìn)行進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀

16、察及評(píng)分，組織學(xué)觀察及評(píng)分， CollagenⅠ，CollagenⅡ和Aggrecan的免疫組化染色，及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組標(biāo)本中SOX-9、CollagenⅠ、CollagenⅡ、Collagen X和Aggrecar基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果在術(shù)后第6周和第12周，單獨(dú)應(yīng)用搭載了雙生長(zhǎng)因子的水凝膠復(fù)合體或同時(shí)結(jié)合ADSCs進(jìn)行軟骨缺損修復(fù)的ICRS評(píng)分和MODS評(píng)分都明顯優(yōu)于另外三組。免疫組化染色結(jié)果顯示此兩組修復(fù)效果顯著。實(shí)