GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體生物學(xué)功能的基礎(chǔ)研究.pdf

1、GDP-巖藻糖是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的。而后被GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi)，在巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下，完成巖藻糖基化修飾。巖藻糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式之一，其對(duì)糖蛋白功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　在本研究以成熟B細(xì)胞受體（BCR）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型（3-83細(xì)胞）作為研究對(duì)象，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)含有兩個(gè)GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（Slc35c1）敲除gRNA序列的pGS-U6-gRNA載體，通過凝集素印記

2、等實(shí)驗(yàn)，篩選最佳gRNA干擾序列。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，把載體導(dǎo)入至3-83細(xì)胞后經(jīng)過G418篩選，挑選單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)免疫印跡技術(shù)鑒定穩(wěn)定遺傳的Slc35c1基因敲除3-83細(xì)胞模型（Slc35c1-3-83-KO）。為建立GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因恢復(fù)細(xì)胞模型，將Slc35c1基因?qū)牖蚯贸?xì)胞中，并連接至另一種病毒載體（pLHCX），通過梭華試劑將其導(dǎo)入到Slc35c1-3-83-KO細(xì)胞中，經(jīng)過200μg/ml潮霉素篩選，獲得

3、Slc35c1基因恢復(fù)模型（Slc35c1-3-83-KO-Re）。利用3-83細(xì)胞、Slc35c1-3-83-KO細(xì)胞及Slc35c1-3-83-KO-Re細(xì)胞，通過MTT及細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞整體水平上檢測(cè)比較三種細(xì)胞的細(xì)胞增殖及細(xì)胞粘附能力，從而探究GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)成熟B細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，Slc35c1-3-83-KO的整體巖藻糖基化及核心巖藻糖基化水平、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附能力顯著低于正常3-83細(xì)胞，而在