神經(jīng)干細胞移植治療缺血性腦卒中的實驗研究.pdf

1、本文對神經(jīng)干細胞移植治療缺血性腦卒中的實驗進行了研究。本研究分為四個部分：
　　第一章：新生小鼠海馬、嗅球及皮質(zhì)神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定。
　　背景：神經(jīng)干細胞是指一組具有自我更新、自我復(fù)制以及定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞潛能的細胞群，主要存在于哺乳動物腦組織中的嗅球、海馬齒狀回、大腦皮質(zhì)、室管膜上區(qū)、脊髓等中樞神經(jīng)組織中。具有多向分化潛能的神經(jīng)干細胞可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。
　　目的：建立一

2、套高效完整的神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)鑒定體系，分別從新生小鼠海馬、嗅球、皮層組織篩選出生物學(xué)性狀均一的種子細胞，建立神經(jīng)干細胞庫，為后續(xù)研究奠定實驗室基礎(chǔ)。
　　方法：分別從新生昆明小鼠分離海馬、嗅球、皮層組織采用機械分離和胰酶消化法提取原代神經(jīng)干細胞。采用無血清培養(yǎng)技術(shù)、機械吹打和酶消化法對提取的原代神經(jīng)干細胞進行培養(yǎng)及傳代純化神經(jīng)干細胞。以10％的胎牛血清誘導(dǎo)分化純化的神經(jīng)干細胞，細胞免疫熒光行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、膠

3、質(zhì)纖維酸性蛋白染色，鑒定神經(jīng)干細胞及其分化產(chǎn)物。細胞凍存與復(fù)蘇技術(shù)建立神經(jīng)干細胞庫。
　　結(jié)果：從新生小鼠海馬、嗅球、皮層可提取出具有自我更新和多向分化能力的神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞巢蛋白、CD133免疫熒光檢測呈陽性；神經(jīng)干細胞經(jīng)胎牛血清誘導(dǎo)后可分化為β-微管蛋白Ⅲ、膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性細胞。
　　結(jié)論：成功建立了新生鼠海馬、嗅球、皮層神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)鑒定體系。
　　第二章：糖氧剝奪對神經(jīng)干細胞增殖、分化及凋亡的

4、影響。
　　背景：缺氧作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)展過程中諸多病理因素中最常見的因素之一，對于內(nèi)源性神經(jīng)干細胞以及移植后外源性神經(jīng)干細胞的存活、遷移、分化、凋亡發(fā)揮著諸多調(diào)控作用。
　　目的：系統(tǒng)觀察體外培養(yǎng)環(huán)境下，糖氧剝奪對神經(jīng)干細胞增殖、分化、凋亡的影響。
　　方法：從新生鼠嗅球分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，建立糖氧剝奪模型，將神經(jīng)干細胞分為常氧組和缺氧組，免疫熒光技術(shù)檢測糖氧剝奪后神經(jīng)干細胞分化能力，MTT法檢測糖氧剝奪24，48

5、 h后恢復(fù)正常條件培養(yǎng)對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響，Hochest33258熒光染色檢測糖氧剝奪24，48 h時后神經(jīng)干細胞凋亡狀況。
　　結(jié)果：第4代神經(jīng)干細胞CD133免疫熒光鑒定結(jié)果呈陽性表達，MTT細胞增殖能力檢測結(jié)果示：糖氧剝奪組增殖能力明顯低于常氧組(P<0.05)，糖氧剝奪48 h組增殖能力低于糖氧剝奪24 h組(P<0.05)。GFAP、β-TubulinⅢ細胞免疫熒光染色結(jié)果示糖氧剝奪48 h時后神經(jīng)干細胞分化為星

6、型膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元總數(shù)明顯低于常氧組(P<0.05)。Hochest33258染色凋亡率檢測結(jié)果示糖氧剝奪組細胞凋亡率明顯高于常氧組(P<0.01)，糖氧剝奪48 h組神經(jīng)干細胞凋亡率顯著高于糖氧剝奪24 h組(P<0.01)。
　　結(jié)論：糖氧剝奪對神經(jīng)干細胞增殖、分化、凋亡造成不利影響，影響程度取決于神經(jīng)干細胞對于缺氧濃度、缺氧時間及自身對于缺氧的耐受性有關(guān)。
　　第三章：光化學(xué)栓塞法建立缺血性腦卒中動物模型。
　　

7、背景：實驗性缺血性腦卒中動物模型作為研究缺血性腦卒中病理機制以及研究開發(fā)新治療方案必不可少的工具，光化學(xué)栓塞法制作缺血性腦卒中動物模型操作簡便，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，研究人員可以針對性的控制梗死灶的位置以及大小，是研究缺血性腦卒中病理機制的良好選擇。
　　目的：建立光栓法缺血性腦卒中動物模型，對比分析性別差異在缺血性腦卒中后梗死體積以及行為學(xué)表現(xiàn)的異同。
　　方法：實驗組分為病理學(xué)檢測其中模型組（n=3）、假手術(shù)組（n=3）各

8、組于建模第7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色觀察梗死后病理學(xué)變化；梗死體積測試組：其中雌性組（n=8）、雄性組（n=8）各組于建模第7d行計算梗死體積大?。恍袨閷W(xué)測試組：雌性假手術(shù)組（n=10），雌性模型組(n=10)，雄性假手術(shù)組(n=10)，雄性模型組(n=9)各組于建模后1、2、3、5、7d行疲勞轉(zhuǎn)棒測試和前肢抓力測試。假手術(shù)組小鼠不注射孟加拉玫瑰紅，其余步驟同模型組。
　　結(jié)果：尼氏染色可見梗死中心神經(jīng)元變性壞

9、死，空泡樣病理改變。Fluoro-Jade C染色可見變性神經(jīng)元陽性表達，雌性組梗死體積顯著小于雄性組，模型組行為學(xué)運動功能受損程度顯著大于假手術(shù)組，其中雌性組運動功能受損程度小于雄性組。
　　結(jié)論：光栓法可以成功建立缺血性腦卒中動物模型，且相同實驗室參數(shù)前提下，缺血性腦卒中對于雄性造成的神經(jīng)功能損傷更為嚴重。
　　第四章：神經(jīng)干細胞移植促進光化學(xué)栓塞動物模型的運動行為功能恢復(fù)。
　　背景：缺血性腦卒中為各種原因所致的

10、腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧性壞死，而出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。是危害中老年人身體健康和生命的主要疾病之一。在過去幾十年中，其發(fā)病率和死亡率持續(xù)性增加，尤其在發(fā)展中國家給患者和家屬帶來了嚴重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)。從新生小鼠海馬分離出的具有向神經(jīng)元以及膠質(zhì)細胞分化能力的神經(jīng)干細胞，為缺血性腦卒中的治療方式帶來的新的曙光。
　　目的：觀察神經(jīng)干細胞移植治療光化學(xué)栓塞腦卒中模型的效果。
　　方法：實驗組分為病理

11、學(xué)檢測組其中移植組（n=6）、假手術(shù)組（n=6）各組于移植后7d行尼氏染色和Fluoro-Jade C染色觀察梗死后病理學(xué)變化；梗死體積測試組：其中神經(jīng)干細胞移植組（n=6）、假手術(shù)組（n=6）各組于移植后第7d行計算梗死體積大??；行為學(xué)測試組：雄性神經(jīng)干細胞移植組（n=10），雄性假手術(shù)組(n=10)，雄性模型組(n=10)各組于建模后1、2、3、5、7、14、21、28d行疲勞轉(zhuǎn)棒測試和前肢抓力測試。假手術(shù)組小鼠不注射孟加拉玫瑰紅，