海洋細(xì)菌HQM9T的鑒定及其瓊膠酶研究.pdf

1、瓊膠酶是一種能夠降解瓊膠，生成瓊膠寡糖的糖苷水解酶。近年來，隨著糖生物學(xué)的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖尤其是新瓊寡糖在誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、抗氧化、抗炎、促進(jìn)雙歧桿菌生長、預(yù)防糖尿病等方面具有顯著的生理活性，因此可廣泛應(yīng)用在食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域。瓊膠寡糖制備方面，傳統(tǒng)的化學(xué)酸解法方法存在著反應(yīng)條件難控制、降解產(chǎn)物不純等問題，而酶解法則有底物專一性強(qiáng)、產(chǎn)物特異性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此對瓊膠酶的研究具有重要意義。本文以本實(shí)驗(yàn)室分離得到的

2、海洋細(xì)菌HQM9T為主要研究對象，完成了其新種鑒定、發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化以及瓊膠酶基因的克隆表達(dá)等工作。
　　海洋細(xì)菌HQM9T分離自生長在威海海域的收集的石花菜表面，是一株具有很強(qiáng)瓊膠降解能力細(xì)菌，在2216E平板上培養(yǎng)3-5天可完全液化平板。HQM9T的呼吸醌類型是MK-6，主要脂肪酸類型是C15∶0iso，C17∶0iso3OH，C16∶1w7c/15iso2OH，C16∶03OH，C16∶0，C17∶02OH，C14∶0，C1

3、3∶1AT12-13，C13∶0iso.主要的極性脂包括磷脂酰乙醇胺和一種未知的脂質(zhì)?；蚪MDNA(G+C)含量是33.20mol％。16SrDNA的測序結(jié)果表明該菌屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）黃桿菌綱（Flavobacteria）黃桿菌科（Flavobacteriaceae），與該科中明確鑒定到種的AquimarinaagarilyticaZCI有最大相似性，為97.09％，可以初步判別為Aquimarina屬的新種，命

4、名為噬瓊膠海水菌Aquimarinaagarivorans，16SrRNA基因序列的GenBank收錄號是HQ593612.本文對其發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化，前期研究實(shí)驗(yàn)確定了其發(fā)酵產(chǎn)酶的基本條件:最適鹽度25‰，初始pH為8.0，附加碳源為瓊脂，氮源為蛋白胨。在此基礎(chǔ)上我們對培養(yǎng)基瓊脂、蛋白胨、酵母粉的添加量，裝瓶量，接種量，發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間等設(shè)計(jì)七因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)(L1837)，獲得該菌產(chǎn)瓊膠酶的最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件為:瓊

5、脂0.5％，蛋白胨0.6％，酵母粉0.08％，NaC125‰，初始pH8.0，裝瓶量50ml(250ml三角瓶)，溫度28℃，接種量0.1％情況下，150rpm/min培養(yǎng)發(fā)酵72h測得最大酶活，可穩(wěn)定在35U.ml-1左右，較優(yōu)化前提高了大約2倍。
　　為了更好地對細(xì)菌HQM9T的瓊膠酶進(jìn)行研究，對其全基因組進(jìn)行了測序。將HQM9T全基因組測序結(jié)果與相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫（包括KEGG,Swissprot,Uniprot等）中已知瓊膠酶

6、基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株含有36個(gè)預(yù)測的瓊膠酶基因，其中19個(gè)屬于GH16家族，其余的不屬于已知家族，基因長度從309bp-5217bp，表明菌株及其瓊膠酶具有新穎性。對HQM9T發(fā)酵后的粗酶液進(jìn)行活性電泳檢測，結(jié)果表明在HQM9T的粗酶液能夠檢測到瓊膠酶組分。質(zhì)譜鑒定的分析結(jié)果表明這七個(gè)酶組分分別為基因aga16A，aga161，aga16L，aga16S，aga16AB，aga16AD，agaAJ編碼的瓊膠酶，其分子量大小分別為96

7、.68kDa，128.19kDa，72.91kDa，98.88kDa,44.35kDa,57.61kDa,73.98kDa。
　　選取pET原核表達(dá)系統(tǒng)對質(zhì)譜鑒定的7個(gè)瓊膠酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)。將此七條基因連入pET-24a(+)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)中構(gòu)建重組菌株。經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測表明轉(zhuǎn)入基因aga16AD的重組表達(dá)菌株有大量符合預(yù)期大小的蛋白表達(dá)，且在菌體

8、破碎上清中能夠檢測到瓊膠酶活性，其他的重組菌株未有明顯蛋白的表達(dá)。通過鎳離子親和層析，對重組瓊膠酶進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE檢測為電泳純。對純化之后的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)重組酶的最適底物濃度為1％，最適溫度為50℃，最適pH為6.0。不同的金屬離子對重組酶的影響不同，Ca2+可以稍微提高重組酶的酶活，K+、Mg2+和Na+對重組酶酶活幾乎無任何影響，而Zn2+、Mn2、+Cu2+、Co2+和Pb2+等重金屬離子，對重