蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物學(xué)手段解析14-3-3ε相互作用復(fù)合物的研究.pdf

1、14-3-3蛋白質(zhì)家族是一個(gè)在真核生物中廣泛表達(dá)的28-33kDa的酸性蛋白質(zhì)。從酵母到哺乳動(dòng)物細(xì)胞都有14-3-3蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且結(jié)構(gòu)和功能非常保守。在哺乳動(dòng)物中有7個(gè)14-3-3亞型(isoform)，分別是β、γ、ε、η、σ、τ和ζ，各個(gè)亞型由不同的基因編碼。目前已報(bào)道有超過(guò)100個(gè)蛋白質(zhì)與14-3-3相互作用，這些與14-3-3相互作用的蛋白質(zhì)涉及到的生物學(xué)功能包括細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激響應(yīng)、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞

2、代謝和參與維持細(xì)胞骨架的完整性等。14-3-3能與如此之多的蛋白質(zhì)相互作用依賴于其特異性的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸底物結(jié)合活性。14-3-3與底物結(jié)合能改變底物（酶）催化活性、影響底物的細(xì)胞定位、介導(dǎo)特定蛋白質(zhì)復(fù)合物形成或者導(dǎo)致底物對(duì)蛋白酶或磷酸酶更為敏感等。
　　14-3-3能結(jié)合和調(diào)節(jié)很多癌基因表達(dá)產(chǎn)物和腫瘤抑制基因的表達(dá)產(chǎn)物，暗示了14-3-3蛋白在癌癥中的潛在重要作用。盡管如此，到目前為止，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)14-3-3具有獨(dú)特的催化

3、能力，其參與到腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中似乎是依賴于其接頭蛋白(adaptor protein)的功能。
　　正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒缘哪[瘤細(xì)胞是一個(gè)多步驟的過(guò)程。該過(guò)程包括細(xì)胞獲得不受調(diào)控的增殖能力、能逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)控的能力、抵抗絀胞凋亡的能力和獲得侵襲和遷移的能力。因此，對(duì)于眾多類型的癌細(xì)胞而言，細(xì)胞功能變異的積累使得癌細(xì)胞在原發(fā)性腫瘤的基礎(chǔ)獲得了侵襲和遷移的能力。14-3-3蛋白幾乎參與到腫瘤發(fā)生和發(fā)展的每一步過(guò)程中。比如14-3-3與

4、癌基因表達(dá)產(chǎn)物Raf、 Bcr和Bcr-Ab1相互作用調(diào)控細(xì)胞增殖;14-3-3與Bad、Bax和ASK-1相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與細(xì)胞凋亡;14-3-3與Foxo相互作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄;14-3-3與腫瘤抑制基因產(chǎn)物p53、TSC2、p27等相互作用參與抑制腫瘤生長(zhǎng);14-3-3與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDC25、Wee1和CHK1等相互作用參與細(xì)胞周期的調(diào)控;14-3-3與integrins和Ron等相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移?？傮w而言，1

5、4-3-3正調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞存活，負(fù)調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或細(xì)胞衰老的過(guò)程。使得14-3-3蛋白有促進(jìn)癌癥發(fā)生和發(fā)展?jié)撃?。但是也有很多?bào)道顯示在DNA損傷時(shí)，14-3-3能使細(xì)胞周期進(jìn)程延滯，暗示了其腫瘤抑制活性。
　　肝癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一。我國(guó)人口的10％左右是乙肝患者或乙肝病毒攜帶者，肝病防治任重道遠(yuǎn)。目前對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制仍有很多謎團(tuán)無(wú)法解答。
　　鑒于14-3-3蛋白與腫瘤發(fā)生與發(fā)展的密切關(guān)系，我們就選取

6、了14-3-3家族中最保守的成員epsilon(ε)亞型，通過(guò)篩選在肝癌細(xì)胞株QGY-7703成功獲得了穩(wěn)定表帶有FLAG標(biāo)簽的14-3-3ε穩(wěn)轉(zhuǎn)株。我們以該細(xì)胞為材料，利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記和生物質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略，定性和定量研究了在天然狀態(tài)和在博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)DNA損傷狀態(tài)下，14-3-3ε在肝癌細(xì)胞中的相互作用狀況。希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛏钊氲亟馕?4-3-3ε的相互作用分子狀況，找出一些有可能參與到

7、肝癌惡化轉(zhuǎn)移的分子，為肝癌的臨床治療提供可能的靶位。
　　論文的研究工作主要包括四個(gè)部分，分述如下:
　?。ㄒ唬┎煌?xì)胞對(duì)博萊霉素應(yīng)答狀況研究
　　博萊霉素(bleomycin，BLM)是一種非常重要的臨床化療藥物，其對(duì)睪丸癌和一些特定類型的淋巴瘤有很好的療效。BLM發(fā)揮化療的機(jī)理是能夠造成DNA單鏈斷裂(DNA single-strand break，SSB)和DNA雙鏈斷裂(DNA double-strandbre

8、ak，DSB)，DSB是BLM誘導(dǎo)的主要產(chǎn)物。BLM造成的大量DSB損傷最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死，從而達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的目的。
　　BLM誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的DSB損傷能激活DSB應(yīng)答機(jī)制。參與DSB應(yīng)答的網(wǎng)絡(luò)及其復(fù)雜。為了更好的了解細(xì)胞對(duì)BLM誘導(dǎo)的DSB損傷應(yīng)答機(jī)制，我們用優(yōu)化好的BLM劑量對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行時(shí)間梯度刺激，通過(guò)檢測(cè)一些潛在的應(yīng)答DSB損傷的信號(hào)分子的活化程度來(lái)尋找合適的DSB損傷應(yīng)答分子標(biāo)志物(biomarker)。我們的實(shí)

9、驗(yàn)表明，H2AX和CHK1的活化程度對(duì)BLM的刺激是時(shí)間依賴性的。H2AX的磷酸化是目前公認(rèn)的由電離輻射造成的DSB損傷應(yīng)答分子標(biāo)志物，CHK1也是目前公認(rèn)的SSB損傷應(yīng)答的分子標(biāo)志物。BLM在細(xì)胞中能同時(shí)造成SSB和DSB，并且二者的損傷程度與BLM的刺激時(shí)間成正相關(guān)。因此，H2AX和CHK1可做為應(yīng)答B(yǎng)LM誘導(dǎo)的DSB損傷分子標(biāo)志物。與此同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)也表明ERK1/2的活化和IκB的降解在不同細(xì)胞中有明顯差異，這說(shuō)明由BLM誘導(dǎo)

10、細(xì)胞MAPKs的活化具有細(xì)胞特異性。
　　我們的實(shí)驗(yàn)第一次比較系統(tǒng)地研究了不同細(xì)胞對(duì)BLM誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答狀況，找到了能用于研究BLM誘導(dǎo)DNA損傷的分子標(biāo)志物（H2AX和CHK1），能夠?yàn)橄嚓P(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了條件。
　?。ǘ┒康鞍踪|(zhì)組學(xué)解析肝癌細(xì)胞在博萊霉素誘導(dǎo)DNA損傷狀況下，14-3-3ε相互作用復(fù)合物的研究
　　DNA損傷修復(fù)失敗或修復(fù)通路缺陷是腫瘤發(fā)生的重要因素。博萊霉素

11、(bleomycin，BLM)是一種抗腫瘤藥物。BLM能通過(guò)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strand break，DSB)而達(dá)到殺傷癌細(xì)胞的目的。BLM在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生的DSB損傷會(huì)激活DSB損傷應(yīng)答通路，以促進(jìn)DSB損傷修復(fù)。DSB損傷應(yīng)答包括細(xì)胞感知DSB損傷、誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程阻滯和激活DSB修復(fù)通路。在DSB損傷應(yīng)答過(guò)程中，蛋白質(zhì)后修飾介導(dǎo)的信號(hào)傳遞廣泛而精密，其中磷酸化修飾發(fā)揮著主要作用。而14-3-3的底物幾乎都

12、是磷酸化的蛋白質(zhì)。因此有理由認(rèn)為14-3-3在應(yīng)對(duì)DSB損傷應(yīng)答過(guò)程中很可能發(fā)揮著重要功能。
　　基于此，我們選取了14-3-3家族中最保守的成員epsilon(ε)亞型，通過(guò)穩(wěn)定同位素體內(nèi)代謝標(biāo)記(AACT/SILAC)結(jié)合免疫共沉淀、高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)方法完成了在BLM誘導(dǎo)DSB損傷條件下14-3-3ε相互作用復(fù)合物的鑒定和定量工作。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，我們找到了30多個(gè)新的與14-3-3ε相互作用的分子。通過(guò)免疫沉淀

13、結(jié)合免疫印跡，我們對(duì)鑒定到的一些分子(NONO、HDAC1、HDAC6、DDB和TAB1)進(jìn)行了驗(yàn)證，其結(jié)果與質(zhì)譜的定量信息是一致的。這些被驗(yàn)證的蛋白質(zhì)參與到蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、泛素化修飾過(guò)程、蛋白質(zhì)激酶信號(hào)通路、RNA加工過(guò)程和蛋白質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過(guò)程中。進(jìn)一步體現(xiàn)和印證了14-3-3ε所參與的生物學(xué)功能廣泛性。
　　基于方法學(xué)和數(shù)據(jù)的可靠性的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步聚焦到一個(gè)非常感興趣的蛋白質(zhì)分子TAK1上

14、。質(zhì)譜和后續(xù)的免疫印跡都證明了TAK1是BLM誘導(dǎo)的14-3-3ε特異性相互作用分子。我們通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)證明14-3-3ε是與TAK1的激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain)相互作用的。功能實(shí)驗(yàn)表明143-3ε與TAK1相互作用能起到維持TAK1處于活化狀態(tài)的功能，從而實(shí)現(xiàn)TAK1的抗BLM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程，促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:1、我們的以穩(wěn)定同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法的可行性和精確性;2、第一

15、次系統(tǒng)地研究和揭示了14-3-3ε在DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中廣泛而重要的作用。通過(guò)我們的結(jié)果很有可能為肝癌的治療提供潛在的作用靶位。
　?。ㄈ?、BLM誘導(dǎo)DNA損傷狀況下，MVP與14-3-3ε相互作用的生物學(xué)功能研究
　　vault顆粒(vault particle)是目前在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的最大的核糖核蛋白復(fù)合物。vault顆粒由至少一個(gè)不翻譯的RNA分子和MVP、PARP4和TEP1三種蛋白組裝而成的一個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)特的“膠囊“

16、狀結(jié)構(gòu)。其中MVP占到vault顆?？偭康?0％以上。MVP幾乎與其他蛋白沒(méi)有同源性，但其本身在進(jìn)化卻極為保守。MVP/vault顆粒結(jié)構(gòu)奇特、進(jìn)化保守，理應(yīng)發(fā)揮保守而重要的生物學(xué)功能。但是，遺憾的是到目前為止，我們對(duì)這個(gè)巨型分子的功能卻知之甚少，研究進(jìn)展極為緩慢。
　　我們利用免疫沉淀結(jié)合生物質(zhì)譜研究在BLM誘導(dǎo)DNA損傷狀況下，14-3-3ε相互作用復(fù)合物時(shí)，非常意外地鑒定到了vault顆粒的所有組成成分，包括MVP，PARP

17、4和TEP1。其中MVP蛋白的質(zhì)譜鑒定得分很高，總共有二十多條肽段匹配到MVP蛋白上。這引起了我們極大地興趣，吸引我們?nèi)ネ诰騇VP/vault顆粒與14-3-3ε的關(guān)系。
　　我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)首先確證了MVP是BLM誘導(dǎo)的14-3-3ε特異性相互作用蛋白質(zhì);其次，我們?cè)贛VP上找到了介導(dǎo)其與14-3-3ε相互作用的磷酸化位點(diǎn)。最后我們通過(guò)生物學(xué)功能分析表明了MVP/vault顆粒有抗BLM誘導(dǎo)DNA損傷的功能，而14-3-3ε則有抑制

18、MVP/vault顆粒促進(jìn)BLM誘導(dǎo)DNA損傷的作用。我們同時(shí)將實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展到了其他表達(dá)MVP/vault顆粒的細(xì)胞中，也觀察到了同樣的現(xiàn)象。這說(shuō)明MVP/vault顆粒與14-3-3ε的相互作用是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)很有可能為臨床化療提供藥物靶位。
　?。ㄋ模?、肝癌細(xì)胞中14-3-3ε天然復(fù)合物狀況研究
　　肝癌細(xì)胞是一種惡性腫瘤細(xì)胞。正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒缘哪[瘤細(xì)胞是一個(gè)多步驟的過(guò)程。該過(guò)程包括細(xì)胞獲得不受調(diào)控的增殖能

19、力、能逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)控的能力、抵抗細(xì)胞凋亡的能力和獲得侵襲和遷移的能力。14-3-3蛋白質(zhì)幾乎參與到腫瘤發(fā)生與發(fā)展的每一步過(guò)程。為了了解14-3-3ε在天然狀態(tài)下，其在肝癌細(xì)胞中的相互作用狀況。我們利用穩(wěn)定同位標(biāo)記(AACT/SILAC)為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)學(xué)研究策略，定性和定量研究了天然狀態(tài)下，肝癌細(xì)胞QGY-7703中14-3-3ε相互作用復(fù)合物狀況。
　　通過(guò)數(shù)據(jù)分析，我們找到了36個(gè)與14-3-3ε特異性相互作用的蛋白質(zhì)。為

20、了驗(yàn)證我們方法的可靠性，我們通過(guò)免疫沉淀和免疫印跡確認(rèn)了14-3-3ζ是14-3-3ε特異性相互作用分子，這與質(zhì)譜的定量結(jié)果相一致;其次，通過(guò)對(duì)這些分子進(jìn)行生物學(xué)功能分類分析，我們發(fā)現(xiàn)這些分子參與到蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、參與細(xì)胞凋亡/死亡過(guò)程、細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞粘連等生理過(guò)程中。細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和抗凋亡的能力是惡性腫瘤的重要特征。細(xì)胞轉(zhuǎn)移依賴于細(xì)胞骨架的變化，惡性腫瘤為了生存演化出了抗細(xì)胞凋亡或死亡的能力。在鑒定到的14-