腰椎黃韌帶增生肥厚演變過(guò)程中氧自由基H2O2的作用機(jī)制.pdf

1、一、研究目的：
　　腰椎黃韌帶肥厚（hypertrophy of the lumbar ligamentum flavum）可與其他多種因素共同作用造成繼發(fā)性腰椎管狹窄(lumbar spinal stenosis，LSS)，其主要臨床表現(xiàn)為腰痛、神經(jīng)根性疼痛、下肢麻木、間歇性跛行等。目前，對(duì)腰椎黃韌帶肥厚的研究主要集中于形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方面，通過(guò)手術(shù)解除馬尾及神經(jīng)根壓迫是當(dāng)前主要治療方式，其病理機(jī)制尚不明確。黃韌帶肥厚的特征性組織

2、學(xué)變化為彈性纖維減少、排列紊亂、撕裂并逐漸消失，膠原纖維增加，最終導(dǎo)致黃韌帶纖維化。TGF-β1、FGF、VEGF、MMP/TIMP等細(xì)胞因子參與黃韌帶肥厚的進(jìn)展。研究表明隨著年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)氧自由基(reactive oxygen species，ROS)堆積，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能受損，而氧自由基的堆積與組織器官退變密切相關(guān)。在多種組織器官中TGF-β1、FGF-2可通過(guò)ERK或NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)膠原蛋白的合成增加，進(jìn)而加速組織退變

3、。本研究旨在明確氧自由基對(duì)腰椎黃韌帶肥厚的影響，探討其是否通過(guò)刺激黃韌帶細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1、FGF-2，進(jìn)而激活ERK1/2-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。
　　二、研究方法：
　?。ㄒ唬┤搜迭S韌帶細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　分離與培養(yǎng):將術(shù)中獲取的腰椎黃韌帶標(biāo)本無(wú)菌條件下以生理鹽水沖洗，無(wú)菌刀片去除非韌帶組織，組織塊貼壁法分離黃韌帶細(xì)胞，細(xì)胞量達(dá)顯微鏡低倍鏡視野70％-80％融合時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取第4代-第6代細(xì)胞傳代至

4、60×15mm培養(yǎng)皿中實(shí)驗(yàn)干預(yù)。
　?。ǘ〩2O2干預(yù)后黃韌帶肥厚相關(guān)指標(biāo)基因及蛋白水平的表達(dá)
　　分組:分為正常對(duì)照組、H2O2濃度50μmol/L組、100μmol/L組、150μmol/L組、200μmol/L組。
　　qRT-PCR:按照實(shí)驗(yàn)分組應(yīng)用H2O2對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)72h，分別提取細(xì)胞總RNA，然后對(duì)TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB進(jìn)行PCR檢測(cè)，觀

5、察各指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　Western-blot:按照實(shí)驗(yàn)分組應(yīng)用H2O2對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)72h，分別提取細(xì)胞總蛋白，然后對(duì)TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB進(jìn)行western-blot檢測(cè)，觀察各指標(biāo)蛋白水平的相對(duì)表達(dá)。
　?。ㄈ〦RK1/2、NF-κB通路的驗(yàn)證
　　ERK1/2通路檢測(cè):200μM濃度的H2O2對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間分別為

6、5min、10min、15min、20min、30min、60min，采用western-blot檢測(cè)p-ERK1/2的蛋白表達(dá)。
　　NF-κB通路檢測(cè):200μM濃度的H2O2對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時(shí)間分別為10min、20min、30min、60min、90min、120min，采用western-blot檢測(cè)p-p65的蛋白表達(dá)。
　　通路阻斷:(1) H2O2濃度200μM，分別采用H2O2、H2O2+HY

7、-15947(ERK1/2通路抑制劑)、H2O2+ Bay11-7082(NF-κB抑制劑)、H2O2+S7959（TGF-β抑制劑）、H2O2+NSC37204（FGF-2抑制劑）對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞干預(yù)72h，western-blot檢測(cè)CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白水平表達(dá)。(2)200μM濃度H2O2+S7959、200μM濃度H2O2+ NSC37204對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞分別干預(yù)15min、20min，應(yīng)用western

8、-blot檢測(cè)p-ERK1/2的蛋白表達(dá);200μM濃度H2O2+S7959、200μM濃度H2O2+ NSC37204對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞分別干預(yù)60min、90min，應(yīng)用western-blot檢測(cè)p-p65的蛋白表達(dá)，驗(yàn)證上下游通路。
　　三、研究結(jié)果：
　?。ㄒ唬┤搜迭S韌帶細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　組織塊貼壁培養(yǎng)法分離細(xì)胞，樣本組織于第14天開(kāi)始有細(xì)胞遷移長(zhǎng)出，以組織塊為中心向外生長(zhǎng)。細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞呈不

9、規(guī)則多角形或橢圓形，胞體平坦，體積適中，胞質(zhì)透亮，細(xì)胞核較大，橢圓形，多為單個(gè)核。
　?。ǘ〩2O2干預(yù)后黃韌帶肥厚相關(guān)指標(biāo)基因及蛋白水平的表達(dá)
　　與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組CollagenⅢ的mRNA相對(duì)水平表達(dá)均顯著升高(p＜0.01); CollagenⅠ的mRNA相對(duì)水平表達(dá)僅在H2O2濃度200μM時(shí)顯著增高(p＜0.05);TGF-β1、FGF-2、NF-κB的mRNA相對(duì)水平表達(dá)在H2O2濃度150μM、200

10、μM組時(shí)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平隨H2O2濃度的增加而顯著增加。
　?。ㄈ〦RK1/2、NF-κB通路的驗(yàn)證
　　ERK1/2通路檢測(cè):200μM濃度的H2O2干預(yù)腰椎黃韌帶細(xì)胞后p-ERK1/2蛋白水平表達(dá)增加;
　　NF-κB通路檢測(cè):200μM濃度的H2O2干預(yù)腰椎黃韌

11、帶細(xì)胞后p-p65蛋白水平表達(dá)增加;
　　通路阻斷:(1)200μM濃度H2O2+S7959、200μM濃度H2O2+ NSC37204分別干預(yù)15min、20min后，p-ERK1/2的蛋白相對(duì)表達(dá)水平較前顯著降低;200μM濃度H2O2+S7959、200uM濃度H2O2+ NSC37204分別干預(yù)60min、90min后，p-p65的蛋白相對(duì)表達(dá)水平較前顯著降低;(2)200μM濃度H2O2+HY-15947、H2O2+Ba

12、y11-7082、H2O2+S7959、H2O2+NSC37204對(duì)腰椎黃韌帶細(xì)胞干預(yù)72h，western-blot檢測(cè)CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白相對(duì)水平表達(dá)較對(duì)照組顯著降低。
　　四、結(jié)論：
　　1.通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)法獲得人腰椎黃韌帶細(xì)胞可作為良好的細(xì)胞分離培養(yǎng)方法用于黃韌帶增生肥厚的分子生物學(xué)研究。
　　2.氧自由基H2O2堆積可促進(jìn)腰椎黃韌帶細(xì)胞TGF-β1、FGF-2、CollagenⅠ、C