基于TGF-β-Smad通路ATRA改善早期頸動(dòng)脈粥樣硬化的作用研究.pdf

1、背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化（arteriosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病發(fā)生與發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，其以血管壁內(nèi)脂質(zhì)蓄積、纖維成分的增加和血管壁慢性炎癥為主要特征。炎癥學(xué)說(shuō)是AS發(fā)病的決定因素，貫穿了AS的形成和發(fā)展過(guò)程。近年的研宄表明，免疫反應(yīng)包括天然免疫和獲得性免疫機(jī)制在AS的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的增強(qiáng)可使斑塊表面纖維帽變薄，增加斑塊的不穩(wěn)定性。因此，炎癥反應(yīng)強(qiáng)度是影

2、響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定向功能性不穩(wěn)定進(jìn)展的重要因素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是維護(hù)易損斑塊穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)。全反式維甲酸（all-trans-ratinoic acid，ATRA)是天然維生素A主要衍生物。最近研宄發(fā)現(xiàn)，ATRA具有介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、凋亡及調(diào)節(jié)免疫等作用。他汀類(lèi)藥物被證明具有調(diào)脂抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定和逆轉(zhuǎn)粥樣硬化斑塊等作用而在臨床上廣泛應(yīng)用。本研宄擬通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)法建立新西蘭白兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型，同時(shí)進(jìn)行辛伐他

3、汀及ATRA的藥物干預(yù)，進(jìn)而觀察辛伐他汀及ATRA對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化中炎癥反應(yīng)的抑制作用，探討ATRA是否通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-0及其下游通路從而抑制炎癥反應(yīng)，改善并穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用，為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建兔頸動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察ATRA與辛伐他汀對(duì)血脂的影響以及頸動(dòng)脈粥樣硬化病灶中細(xì)胞增殖及炎癥的抑制作用，通過(guò)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的炎癥下游分子研宄，探討ATRA基于TGF-0/Sma

4、d通路改善早期頸動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。
　　方法：
　　1、將34只健康純種雄性新西蘭白兔隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（n=6)、模型對(duì)照組（n=8)、辛伐他汀治療組（n=10)、ATRA治療組（n=10)。正常對(duì)照組給予普通飲食，其余各組給予高脂飼料。實(shí)驗(yàn)4周后辛伐他汀治療組予辛伐他汀2mg/kg·d灌胃給藥，ATRA治療組予ATRA20mg/d灌胃給藥，模型對(duì)照組不使用任何藥物，但予以等量生理鹽水灌胃。
　　2、實(shí)驗(yàn)

5、12周末心臟取血，室溫靜置后離心取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總膽固醇（TC)、甘油三酯（TG)、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC)、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDLC)的濃度。并采用酶聯(lián)免疫吸附試劑法（ELISA法）測(cè)定血清中TGF-0、IL-6、IL-10、IL-17的水平。
　　3、留取血標(biāo)本后以空氣栓塞法處死動(dòng)物，取頸動(dòng)脈組織，石蠟包埋，對(duì)頸動(dòng)脈進(jìn)行冊(cè)染色，觀察斑塊破裂率。
　　4

6、、收集頸動(dòng)脈組織，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)頸動(dòng)脈組織中Foxp3、TGF-0、IL-10, MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平。
　　5、所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0、Graphpad Prism5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。首先對(duì)數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組間用t檢驗(yàn);多組間參數(shù)比較采用單因素方差分析；多組均數(shù)兩兩比較采用檢驗(yàn)分析；對(duì)不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；對(duì)有相關(guān)

7、趨勢(shì)的變量采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)過(guò)程順利，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組無(wú)死亡，但模型對(duì)照組可見(jiàn)有脫毛，皮膚、足趾潰爛等情況。辛伐他汀治療組發(fā)生腹瀉、絕食死亡2只。ATRA治療組因灌胃不當(dāng)所致死亡2只。所得30只動(dòng)物數(shù)據(jù)參與分析，正常對(duì)照組6只，模型對(duì)照組8只，辛伐他汀治療組8只，ATRA治療組8只。
　　2、血脂水平變化：高脂飼料喂養(yǎng)能夠形成顯著的高脂血癥，

8、模型對(duì)照組較正常對(duì)照組TC、LDL-C顯著升高，辛伐他汀能夠有效的降低TC、LDL-C，但ATRA治療組高脂血癥無(wú)明顯改善。
　　3、取兔頸動(dòng)脈行染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組兔頸動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整，排列整齊，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)規(guī)則，未見(jiàn)明顯斑塊形成；模型對(duì)照組兔頸動(dòng)脈可見(jiàn)典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，內(nèi)有纖維帽及脂質(zhì)核心，以及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)彈力纖維膜斷裂，平滑肌細(xì)胞迀移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜可見(jiàn)泡沫

9、細(xì)胞及膽固醇結(jié)晶。辛伐他汀治療組及ATRA治療組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)尚完整，部分中斷，內(nèi)彈力纖維膜清晰完好，可見(jiàn)部分平滑肌細(xì)胞迀移至內(nèi)膜下，動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞排列尚整齊，可見(jiàn)部分泡沫細(xì)胞形成及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　4、ELISA法結(jié)果：與模型對(duì)照組相比，辛伐他汀及ATRA治療均明顯提高了血清中抗炎因子TGF-0和IL-10的水平濃度，并降低了促炎因子IL-6、IL-17的水平濃度。
　　5、RT-PCR結(jié)果：實(shí)時(shí)定量RT-PC

10、R結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組兔頸動(dòng)脈組織中TGF-01、IL-10、Foxp3 mRNA的含量明顯降低，有顯著性差異（P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，辛伐他汀治療組和ATRA治療組的抗炎因子TGF-01、IL-10、Foxp3 mRNA的含量明顯升高，有顯著性差異（P<0.05)，但兩者間對(duì)比作用差異不明顯（P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組兔頸動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9 mRNA的含量明顯升高，有顯著性差

11、異（P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，辛伐他汀治療組和ATRA治療組的MMP-2、MMP-9 mRNA的含量明顯降低，有顯著性差異(P<0.05)，但兩者間對(duì)比作用差異不明顯(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)辛伐他汀能夠有效的改善高膽固醇血癥，而ATRA對(duì)血脂水平無(wú)明顯影響，其不是通過(guò)降低血脂水平來(lái)減輕動(dòng)脈粥樣硬化。
　　(2) ATRA通過(guò)TGF-0/Smad通路刺激Foxp3的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞