缺第4外顯子的IL-7剪接變異體蛋白的活性研究.pdf

1、白細胞介素7（interleukin-7,IL-7)的全長基因全長包含6個外顯子(531bp），當受某些因素影響導(dǎo)致其中的一個或幾個外顯子被跳過，便形成了許多長短不一的、來源相同基因的mRNA，從而產(chǎn)生新的不同 IL-7剪接變異體蛋白。IL-7δ4是IL-7缺第4外顯子的剪接變異體，其一級結(jié)構(gòu)與IL-7有差異，其功能可能參與IL-7功能調(diào)節(jié)，甚至獲得新功能或與 IL-7功能相拮抗。正常人體內(nèi)多個器官都能檢測到 IL-7δ4 mRNA，但

2、其生物功能尚未清楚。此外，在多個腫瘤細胞株、多發(fā)性硬化癥病人中其mRNA水平異常增高，IL-7δ4是否參與了相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展亦有待研究。
　　目的：
　　本文將利用原核表達載體pET-21b表達IL-7δ4，經(jīng)復(fù)性、純化及Westren-blot鑒定，獲得具有生物活性的IL-7δ4蛋白，并對其活性功能進行研究,這對其正常生理功能的探討、相關(guān)疾病的及時診治都具有十分重要意義。
　　方法：
　　1. rhIL-7δ

3、4蛋白的制備：利用本室保存的18-T-IL-7δ4為模板進行亞克隆，構(gòu)建rhIL-7δ4原核表達載體pET-21b-IL-7δ4，對其進行誘導(dǎo)表達及可溶性分析，并優(yōu)化表達條件。rhIL-7δ4蛋白以包涵體形式表達，采用梯度透析法進行復(fù)性，并經(jīng)過親和層析色譜法純化。最后，分別以6×His小鼠單克隆抗體和鼠抗人IL-7抗體為一抗，對純化后rhIL-7δ4蛋白進行Western Blot鑒定。
　　2. rhIL-7δ4蛋白對正常人外周

4、血單核細胞的作用：BCA法測定其濃度后，以rhIIL-7為陽性對照研究rhIIL-7δ4的活性，采用Western-bolt法檢測其對外周血單核細胞凋亡蛋白 BCL-2表達，以及應(yīng)用流式細胞術(shù)分析其對人外周血單核細胞凋亡的影響。
　　3. rhIL-7δ4蛋白對肺成纖維細胞 MCR-5的影響：以 TGF-β1、rhIL-7、rhIL-7δ4干預(yù)MCR-5細胞，MTT法檢測其增殖率，以及Western-blot法檢測collagen

5、 I、α-SMA蛋白表達。
　　結(jié)果：
　　1. rhIL-7δ4蛋白的原核表達、復(fù)性及純化：成功構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET-21b-IL-7δ4。PCR可擴增出約399bp的目的片段，與預(yù)期的一致，且測序結(jié)果與GenBank中IL-7δ4基因序列比較，彼此完全吻合。通過稀釋與梯度透析過程，rhIL-7δ4蛋白的復(fù)性效率可達65％，純化后其純度均達到了95%以上，且純化樣品經(jīng)Western Blot證實為rhIL-7δ4。

6、
　　2. rhIL-7δ4蛋白對正常人PBMCs的作用：在體外，rhIL-7δ4能明顯提高PBMC的BCL-2蛋白表達，抑制PBMCs的凋亡（P<0.01），與rhIL-7作用是一致的。
　　3. rhIL-7δ4蛋白對MCR-5細胞的作用：當TGF-β1、rhIL-7、rhIL-7δ4分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細胞，都促進細胞增殖（P<0.01），但作用強度有差異（TGF-β1>rhIL-7δ4>rhIL-7），且都

7、能誘導(dǎo)細胞collagen I、α-SMA蛋白表達增加（P<0.05)。當TGF-β1分別與rhIL-7及rhIL-7δ4合用時，上述的蛋白表達增加效應(yīng)更明顯，而預(yù)先用以IL-7R抗體處理MRC-5細胞，則能逆轉(zhuǎn)rhIL-7及rhIL-7δ4的蛋白表達誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　本研究采用原核表達系統(tǒng)表達rhIL-7δ4蛋白，優(yōu)化其表達條件，經(jīng)過復(fù)性和純化，成功獲得高純度的rhIL-7δ4蛋白。在體外，rhIL-7δ4能明顯