缺第4和5外顯子的IL-7剪接變異體蛋白表達(dá)及活性研究.pdf

1、研究背景：
　　機(jī)體多種細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-7，其主要生物作用是參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)；IL-7有多個(gè)剪接變異體，其生物活性的研究才剛剛開(kāi)始。研究報(bào)道 IL-7具有強(qiáng)大的抗纖維化作用，其作用機(jī)制主要為通過(guò)激活 JAK1/STAT1信號(hào)通路上調(diào) Smad7表達(dá)及下調(diào)TGF-β1的表達(dá)以阻斷TGF-β誘導(dǎo)膠原合成。IL-7δ4/5是I L-7缺第4和第5外顯子的剪接變異體，其生物學(xué)作用的研究才剛展開(kāi)，其是否也影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展亦有待研究

2、。
　　研究目的：
　　本課題利用原核表達(dá)載體pET-21b表達(dá)I L-7δ4/5蛋白，包涵體經(jīng)溶解、復(fù)性、純化后，獲得復(fù)性的高純度的蛋白質(zhì)，經(jīng)Western-blot鑒定后，采用TGF-β1和IL-7作為對(duì)照分析其對(duì)肺成纖維細(xì)胞MRC-5的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.IL-7δ4/5蛋白的制備：以18-T-IL-7δ4/5（實(shí)驗(yàn)室保存）作為模板進(jìn)行亞克隆，在成功構(gòu)建IL-7δ4/5原核

3、表達(dá)質(zhì)粒pET-21b-IL-7δ4/5后，進(jìn)行誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白質(zhì)可溶性分析，進(jìn)一步優(yōu)化其誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，以確定最佳參數(shù)。IL-7δ4/5蛋白包涵體經(jīng)溶解后，蛋白的復(fù)性用梯度透析法，純化用親和層析色譜法。純化后，以鼠抗人IL-7抗體和6×His單克隆抗體為一抗，分別對(duì)IL-7δ4/5蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。
　　2.IL-7δ4/5蛋白對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞 MRC-5的影響：分別用 IL-7、IL-7δ4/5和

4、TGF-β1作用于M RC-5細(xì)胞，細(xì)胞增殖用MTT法檢測(cè)，colla ge nI、α-SMA蛋白表達(dá)用Western-blot法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.IL-7δ4/5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、復(fù)性及純化：重組表達(dá)質(zhì)粒 p ET-21b-IL-7δ4/5構(gòu)建成功。進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增的目的片段約為345bp，和預(yù)期結(jié)果相符；測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)：結(jié)果與GenBank中IL-7δ4/5基因序列完全一致。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)和IP

5、TG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳證實(shí)其誘導(dǎo)表達(dá)成功。分離純化的包涵體進(jìn)行溶解、稀釋與梯度透析后，IL-7δ4/5蛋白的復(fù)性效率達(dá)到45％，利用親合層析色譜法純化后，蛋白質(zhì)的純度達(dá)到了95%以上，最后用Western Blot法進(jìn)行證實(shí)。
　　2.IL-7δ4/5蛋白對(duì)MRC-5細(xì)胞的作用：TGF-β1、IL-7、IL-7δ4/5分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞，結(jié)果TGF-β1能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖（P<0.01），明顯誘導(dǎo)細(xì)胞c