1,25-(OH)2D3對INS-1胰島細(xì)胞自噬功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿?。―iabetes Mellius，DM）是由多種因素引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。胰島β細(xì)胞的功能異常和數(shù)量減少引起的胰島素分泌不足是糖尿病發(fā)病的主要原因。1,25-(OH)2D3(VitD3)是維生素D的活性形式，通過與靶細(xì)胞上的維生素D受體（Vitamin D receptor，VDR）結(jié)合，發(fā)揮其作用。自噬是進(jìn)化上非常保守的過程，在正常條件下基礎(chǔ)自噬主要是清除、降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和長壽命蛋白，通過這種方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器

2、的自我更新，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要的生物學(xué)意義。
　　目的：
　　1.探究維生素D對鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ)所致INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　2.探討維生素D對胰島細(xì)胞的分泌與自噬功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法：
　　培養(yǎng)具有大鼠胰島β細(xì)胞生理特性的細(xì)胞株INS-1細(xì)胞，將INS-1細(xì)胞分為正常對照組和不同濃度的VitD3組（包括10-6 mmol/L組、10-7 mmol/L組、10

3、-8 mmol/L組、10-9 mmol/L組），作用24小時(shí)后，CCK8法檢測各組細(xì)胞的增殖活性；ELISA測定不同濃度的VitD3對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響，確定VitD3對INS-1細(xì)胞作用的最適濃度。將INS-1細(xì)胞分為空白對照組(CON)、VitD3對照組(VitD3)、STZ損傷組(STZ)、VitD3預(yù)防組(VitD3+STZ)、VitD3治療組（STZ+VitD3），各組作用結(jié)束后，CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力；收集

4、培養(yǎng)液，ELISA測定各組細(xì)胞的胰島素分泌情況；ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的含量和細(xì)胞總抗氧化能力（Cellular total antioxidant capacity,T-AOC）的水平；提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)，分別用RT-PCR和Western-Blot檢測細(xì)胞自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平；收集各組細(xì)胞，制作超薄切片，應(yīng)用透射電鏡觀察各組細(xì)胞中的自噬體和超微結(jié)構(gòu)的變化。

5、　　結(jié)果:
　　1. VitD3對INS-1細(xì)胞分泌的影響
　　與正常對照組相比，濃度為10-7 mmol/L的VitD3顯著促進(jìn)了INS-1細(xì)胞的增殖活性和胰島素的分泌（P<0.01）。而其他濃度的VitD3組與對照組相比均無顯著性差異（P>0.05）。
　　2.VitD3對STZ所致INS-1細(xì)胞損傷的影響
　　與正常對照組相比，STZ損傷組的細(xì)胞增殖活性、胰島素分泌水平和T-AOC明顯降低(P<0.001)

6、，MDA含量升高（P<0.001）；VitD3預(yù)防組和治療組的細(xì)胞增殖活性、胰島素分泌和T-AOC水平也顯著降低（P<0.01），MDA含量則顯著升高（P<0.01）；與STZ損傷組相比，VitD3保護(hù)組和修復(fù)組的細(xì)胞增殖活性、胰島素分泌和T-AOC水平顯著升高（P<0.01），MDA含量則顯著降低（P<0.01）。
　　3.VitD3對STZ損傷的INS-1細(xì)胞自噬功能的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，V

7、itD3對照組、VitD3預(yù)防組和治療組的自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3的表達(dá)量明顯升高（P<0.01）；Western-Blot結(jié)果亦顯示同樣的規(guī)律。透射電鏡下觀察，正常 INS-1細(xì)胞呈現(xiàn)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞器排列有序，分泌大量的胰島素顆粒；STZ損傷組細(xì)胞受損嚴(yán)重，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體脊斷裂，數(shù)量減少，細(xì)胞核染色體聚集，少量細(xì)胞出現(xiàn)凋亡特征，胰島素分泌顆粒少見等現(xiàn)象；VitD3預(yù)防組和治療組細(xì)胞損傷程度減小，超微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)

8、，趨于正常，細(xì)胞內(nèi)可見雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體；VitD3對照組INS-1細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和正常對照組相似，可見少量處于不同階段的自噬體。
　　結(jié)論:
　　1.VitD3可以減小STZ所致INS-1細(xì)胞的損傷，促進(jìn)其胰島素的分泌。
　　2.VitD3可促進(jìn)STZ作用前后INS-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。提示VitD3可能通過誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的自噬，清除STZ損傷的細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)對I