水通道蛋白Z在大腸桿菌中的高效表達(dá)及分離純化.pdf

1、Aquaporin Z(AqpZ)是位于大腸桿菌細(xì)胞膜上的一類強(qiáng)疏水性跨膜蛋白，為水分子進(jìn)出細(xì)胞提供專一性的跨膜通道，是重要固在蛋白家族通道蛋白的重要成員。由于其極高的水滲透性，穩(wěn)定性及極低的活化能，AqpZ在發(fā)展仿生水過濾技術(shù)方向受到了眾多的關(guān)注。獲得足夠量的AqpZ仍然是發(fā)展該項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)重要瓶頸。
　　 本文采用麥芽糖結(jié)合蛋白/多聚組氨酸構(gòu)成的強(qiáng)親水性二元親和標(biāo)簽表達(dá)系統(tǒng)用于AqpZ的功能性重組表達(dá)。首先PCR手段在Aqp

2、Z基因下游引入8個(gè)組氨酸標(biāo)簽后連接到麥芽糖結(jié)合蛋白融合載體pMAL-p2及pMAL-c5e上成功構(gòu)建表達(dá)載體pMAL-p2-AqpZ-HIS和pMAL-c5e-AqpZ-HIS。接著，考察不同表達(dá)宿主和表達(dá)優(yōu)化條件對融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的上清表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明超表達(dá)MBP-AqpZ-HIS沒有誘發(fā)細(xì)胞毒性，并且在最佳表達(dá)條件下MBP-AqpZ-HIS上清表達(dá)表達(dá)量可以到達(dá)262 mg/L水平。對細(xì)胞膜的分離發(fā)現(xiàn)MBP-

3、AqpZ-HIS幾乎全部表達(dá)于細(xì)胞膜上。采用特異性酶切的方法將AqpZ-HIS從融合蛋白中釋放出來，并以親和層析為基礎(chǔ)，根據(jù)融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了兩套分離純化AqpZ-HIS的策略。經(jīng)過最后一步親和層析分離都可以得到高純度的AqpZ-HIS。其SDS-PAGE的電泳行為和色氨酸熒光激發(fā)光譜表明了純化后AqpZ-HIS以四聚體形式存在并具有強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，暗示著其空間結(jié)構(gòu)的正確折疊。
　　 以上結(jié)果表明了，麥芽