核糖核酸酶A包含體高效復(fù)性方法的研究.pdf

1、受二硫鍵正確生成速率慢和蛋白質(zhì)聚集的影響,核糖核酸酶A(RNase A)包含體的高濃度復(fù)性成為制約RNase A大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素。因此,本文從促進(jìn)二硫鍵形成和抑制蛋白質(zhì)聚集兩方面,研究開發(fā)了輔助RNase A包含體高效復(fù)性的方法。
　　為了提高RNase A內(nèi)二硫鍵正確生成的速率,本研究提出以4-巰基苯乙酸為還原劑(ArSH)、己酰胱胺(HCA)為氧化劑組成新型氧化還原系統(tǒng)(ArSH/HCA)輔助RNase A復(fù)性。研究結(jié)果顯

2、示,相對(duì)于傳統(tǒng)的氧化還原系統(tǒng)(還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽,GSH/GSSG),ArSH/HCA可以顯著加速RNase A的復(fù)性,使變性還原的商品RNase A(0.3mg/mL)2h的復(fù)性收率達(dá)94％,復(fù)性速度提高2倍;亦使RNase A包含體(含RNase A 0.3mg/mL)3h的復(fù)性收率達(dá)89%,復(fù)性時(shí)間縮短了60%。體現(xiàn)出新的氧化還原系統(tǒng)輔助RNase A復(fù)性的優(yōu)勢(shì)。
　　高濃度RNase A包含體復(fù)性時(shí),蛋白質(zhì)聚集

3、是復(fù)性收率低下的主要原因。為了解決這一問題,本研究首先根據(jù)本研究室前人發(fā)現(xiàn)的同電荷介質(zhì)通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子在帶電介質(zhì)表面定向排列,從而降低蛋白質(zhì)聚集促進(jìn)復(fù)性的機(jī)理,制備了電荷密度不同的帶電介質(zhì),考察了它們輔助高濃度RNase A包含體的復(fù)性效果。結(jié)果顯示,帶電荷介質(zhì)可使RNase A包含體(蛋白總濃度為1.4mg/mL,RNase A濃度為0.9mg/mL)的復(fù)性收率達(dá)63%,較稀釋復(fù)性收率(49%)提高29%。同時(shí)發(fā)現(xiàn),高電荷密度介質(zhì)在

4、低濃度范圍內(nèi)即可獲得顯著的輔助復(fù)性效果,體現(xiàn)出其在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)。
　　另外,本研究還考察了人工分子伴侶系統(tǒng)(十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)/β-環(huán)糊精(β-CD))與新氧化還原系統(tǒng)耦合輔助高濃度RNase A包含體的復(fù)性。研究發(fā)現(xiàn),在低脲素濃度(0.8mol/L)時(shí),人工分子伴侶可抑制蛋白質(zhì)聚集,顯著提高RNase A的復(fù)性收率,使0.9mg/mLRNase A(包含體蛋白質(zhì)濃度為1.4mg/mL)復(fù)性收率達(dá)77%,較稀釋復(fù)