苯酚生物合成工程菌株的代謝工程.pdf

1、苯酚是一種基本有機化工原料，主要用于生產(chǎn)某些樹脂、雙酚A、己二酸及藥物等，因此苯酚生產(chǎn)具有良好的發(fā)展前景，苯酚的化學合成雖具有較多優(yōu)勢但仍存在生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染大、副產(chǎn)物多等一系列問題。甘油資源豐富、價格低廉，由于其C原子的高度還原性，在燃料和化學品生產(chǎn)中具有比普通糖如葡萄糖等更高的收益。本文從上述兩個方面考慮，探索一條利用甘油為原料，在大腸桿菌中構(gòu)建苯酚的發(fā)酵生產(chǎn)途徑，研究結(jié)果如下：
　?。?）TPL（編碼酪氨酸苯酚裂解酶）基

2、因密碼子優(yōu)化及酶活測定。將來源于Enterobacter agglomerans的TPL野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好的密碼子優(yōu)化序列，重組菌Escherichia coli BL21（pET28a-TPL）經(jīng)蛋白表達可催化10mM底物酪氨酸生成5.66mM苯酚，TPL酶活力得到驗證。
　?。?）利用甘油生產(chǎn)苯酚代謝途徑的打通。該途徑涉及到兩個關(guān)鍵酶，即TPL和P4M（編碼苯丙氨酸-4-單加氧酶），苯丙氨酸在苯丙氨酸-4-單

3、加氧酶催化下生成酪氨酸，然后在酪氨酸苯酚裂解酶催化下生成苯酚。構(gòu)建了重組大腸桿菌Escherichia coli ATCC31884（pTrc99a-TPL-P4M），命名為PH1，利用甘油發(fā)酵測得苯酚的生成，產(chǎn)量為21.30mg/L。
　?。?）甘油利用基因表達水平的增強。甘油的利用涉及到兩個酶，即果糖-1,6-二磷酸酶（GlpX）和轉(zhuǎn)酮醇酶（TktA）。構(gòu)建重組大腸桿菌 Escherichia coli ATCC31884（p

4、Trc99a-TPL-P4M-trcGlpX-TktA），命名為菌株P(guān)H2，利用甘油發(fā)酵測得苯酚的生成，產(chǎn)量為27.68mg/L。經(jīng)發(fā)酵檢測后結(jié)果分析P4M為限速酶，因此又構(gòu)建重組大腸桿菌Escherichia coli ATCC31884（pTrc99a-TPL-trcP4M-trcGlpX-TktA），命名為菌株P(guān)H3，利用甘油發(fā)酵測得苯酚產(chǎn)量為57.66mg/L。
　?。?）增加莽草酸途經(jīng)中前體磷酸烯醇式丙酮酸的供應。采用R

5、ed同源重組技術(shù)首先敲除基因pykF（編碼丙酮酸激酶），其次敲除基因ptsI（編碼蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶）和基因ppc（編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶），質(zhì)粒pTrc99a-TPL-trcP4M-trcGlpX-TktA分別電轉(zhuǎn)化基因敲除后的3株重組菌株，得到菌株P(guān)H4、PH5、PH6，利用甘油發(fā)酵測得苯酚產(chǎn)量分別為88.38mg/L、123.85mg/L和127.60mg/L。
　?。?）發(fā)酵優(yōu)化。為提高苯酚產(chǎn)量，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并采