魚腥藻PCC 7120中幾個固氮相關基因的功能驗證.pdf

1、分 類 號：Q78 密 級： 碩 士 學 位 論 文 魚腥藻 PCC 7120 中幾個固氮相關基因的功能驗證 黃 香 陽 第 一 指 導 教 師 ： 第 一 指 導 教 師 ： 何 平 副教授 第 二 指 導 教 師 ： 第 二 指 導 教 師 ： 學 院 名 學 院 名 稱： 生命科學學院 專 業(yè) 學 位 類 別 ： 專 業(yè) 學 位 類 別 ： 工程碩士 領 域 ： 域 ： 生物工程 答辯委員會主席： 答辯委

2、員會主席： 朱國輝 副教授 中國·廣州 2016 年 6 月 摘 要 魚腥藻 PCC 7120（Anabaena sp. PCC 7120）在細菌發(fā)育學和多細胞結構的研究中，是一種典型的模式生物。在缺乏化合氮源的環(huán)境中，絲狀體中的營養(yǎng)細胞能分化成為具有特殊結構的異形胞。主要研究內容如下：在實驗室研究基礎上，選擇可能與固氮有關的靶基因，利用 pZR606 敲除某一個

3、靶基因，觀察敲除菌株在不含有化合氮源上的培養(yǎng)條件下的表型變化，確定可能與魚腥藻 PCC 7120 細胞固氮相關的基因；選用含有 PglnA 強啟動子的 pZR670 質粒作為互補表達質粒，構建含有靶基因啟動子序列的互補型表達質粒， 觀察互補菌株是否在恢復一定的表達后能使細胞在缺少化合氮源的培養(yǎng)基上恢復生長，從而確定與固氮相關的基因；通過分析魚腥藻 PCC 7120的轉錄組數(shù)據，選擇在缺氮和有氮條件下不同表達量的 sRNA，利用 pZR6

4、70 構建干涉質粒，通過三親接合轉移方法獲得干涉菌株，觀察干涉在培養(yǎng)過程中所引起的細胞形狀的變化，確定能引起魚腥藻 PCC 7120 細胞型狀改變的 sRNA 序列。 主要研究結果如下： 取生長狀態(tài)良好的魚腥藻 PCC 7120 細胞，接種于 AA/8 和 AA/8N 液體中培養(yǎng)，通過測量魚腥藻 PCC 7120 細胞在 700 nm 處的吸光度值， 觀察細胞的生長狀態(tài)， 通過生長曲線分析，氮源是細胞生長的一種限制性因素，也是異形胞形成

5、的關鍵元素。 成功利用單交換基因重組技術，以 pZR606 質粒為基本骨架，構建了 all2022、all2676、 alr0834 基因的敲除質粒 pHEP52、 pHEP34 和 pHEP55， 敲除了 all2022、 all2676、alr0834 基因，獲得了基因敲除菌株 Δall2022、Δall2676、Δalr0834，在不含有化合氮源的 AA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其生長變化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)此三種敲除菌株在不含化合氮源的培養(yǎng)基培

6、養(yǎng)條件下，魚腥藻 PCC 7120 在培養(yǎng)一段時間后均會變黃死亡。 成功利用表達質粒 pZR670 構建了 all2022、all2676、alr0834 基因的互補質粒pHEP90、 pHEP91、 pHEP92， 通過三親結合轉移獲得其互補菌株▲all2022、 ▲all2676、▲alr0834，將獲得的互補菌株在不含有化合氮源的 AA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，▲all2676 和▲alr0834 在培養(yǎng)一段時間后能恢復生長，而▲all20