藍藻水華衍生的脅迫因子對枝角類生活史參數(shù)及抗氧化酶基因表達的影響.pdf

1、富營養(yǎng)化最明顯的表征之一是暴發(fā)藍藻水華。藍藻水華大規(guī)模持續(xù)暴發(fā)會嚴重影響水質和生態(tài)系統(tǒng)結構與功能，尤其在藍藻衰亡降解過程中，藻細胞死亡分解耗氧過多會導致需氧生物缺氧死亡，還會釋放有毒有害物質，如藻毒素、含氮化合物等。為了探討藍藻水華降解過程中形成的脅迫因子對水體中主要浮游動物類群枝角類的影響，本研究選擇太湖常見種擬同形溞(Daphnia similoides)、同形溞(Daphnia similis)和生態(tài)毒理檢測模式生物大型溞(Dap

2、hnia magna)為實驗材料，通過低溶氧、氨、微囊藻毒素和亞硝酸鹽對枝角類單一和復合暴露實驗，研究水華衍生的脅迫因子對枝角類生活史參數(shù)及抗氧化酶基因表達的影響。主要結果如下:
　　1.在不同溶氧水平對D.similoides影響的21天慢性實驗中，觀察了存活、生長及繁殖方面的生活史參數(shù)變化。發(fā)現(xiàn)低溶氧會減少D.similoides的存活時間、蛻皮次數(shù)、阻礙生長、推遲個體成熟和抑制繁殖，因此低溶解氧對D.similoides的生

3、活史參數(shù)具有顯著的負面效應。利用直角曲線模型能較好地擬合平均存活天數(shù)、蛻皮次數(shù)、繁殖窩數(shù)和總繁殖量隨著溶氧梯度的變化。通過該模型分別得到上述參數(shù)的EC50（半效應濃度）分別為2.45、2.95、2.40、3.29 mg L-1，表明繁殖對低溶氧脅迫較敏感。由結果可推測，溶解氧的下降會對D.similoides種群產生不利的影響。
　　2.把D.similis暴露于不同濃度非離子氨和低溶氧復合條件下14天，結果發(fā)現(xiàn)(1)低溶氧能減少

4、D.similis的存活天數(shù)和蛻皮次數(shù)，同時在低溶氧下0.48 mg L-1NH3顯著影響存活和蛻皮;(2)非離子氨能顯著推遲個體的性成熟時間并且抑制個體生長;(3)非離子氨和低溶氧都能抑制母體的繁殖能力，包括繁殖窩數(shù)、總繁殖量和平均繁殖量。因此，我們認為非離子氨能協(xié)同低溶氧對枝角類D.similis的生活史參數(shù)起到復合抑制作用。
　　3.已報道的文獻認為非離子氨，低溶氧，藻毒素等藍藻脅迫因子會破壞水生動物物的抗氧化系統(tǒng)。本實驗根

5、據(jù)參照Tigriopus japonicas和Cherax quadricarinatusMn-SOD基因，設計引物克隆出D.magna Mn-SOD(Dm-Mn-SOD)基因，隨后研究了該基因在水華衍生脅迫因子藻毒素和亞硝酸鹽刺激下的表達模式。Dm-Mn-SOD cDNA全長955 bp，含有一個完整的開放閱讀框，編碼的多肽由共編碼215個氨基酸，理論分子量為24594.24 kDa，等電點為7.10。利用MEGA5.03軟件對Dm-

6、Mn-SOD編碼的蛋白質序列進行分析計算遺傳距離，采用鄰接法構樹，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的線粒體Mn-SOD親緣關系最近，而且利用ClustalW同源比對分析，發(fā)現(xiàn)Dm-Mn-SOD與Dromia personata(75％)、Cancer pagurus(75％)和Carcinus maenas(75％)都具有相似的同源性。利用Real-time PCR技術，檢測在藻毒素和亞硝酸鹽脅迫下的表達情況，發(fā)現(xiàn)較低的亞硝酸鹽濃度和藻毒素都能上調Dm

7、-Mn-SOD基因的表達。線粒體是細胞中能量合成的場所，Dm-Mn-SOD基因在保護機體，尤其是清除線粒體內的自由基起著重要作用，為維持細胞正常能量代謝提供保障。結合本研究基因表達的結果推測，亞硝酸鹽和藻毒素能造成機體氧化脅迫，機體為了清除線粒體內過多的氧自由基，上調了Mn-SOD基因表達。
　　4.為了從基因表達水平研究藍藻水華衍生的脅迫因子對枝角類抗氧化酶系統(tǒng)的影響，本實驗首先克隆出了水體污染物檢測常見模式生物D.magna的

8、Cu/Zn-SOD基因，隨后研究了該基因在藍藻水華衍生的兩種脅迫因子非離子氨和低溶氧刺激下的表達模式。該基因全長eDNA序列已提交給GenBank，登錄號為JX456347。D.magna Cu/Zn-SOD(Dm-Cu/Zn-SOD) eDNA全長537 bp，含有一個完整的開放閱讀框，編碼的多肽由共編碼178個氨基酸，理論分子量為16.11 kDa，等電點為5.84。該多肽含有一個由21個氨基酸組成的信號肽，表明它是胞外Cu/Zn-

9、SOD。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)該多肽有兩個Cu/Zn結構域，各有四個Cu2+和Zn2+結合位點。通過同源性比對發(fā)現(xiàn)，Dm-Cu/Zn-SOD與Daphniapulex(88％)、Alvinella pompejana(56％)和Cristaria plicata(56％)具有較高的同源性。利用Real-time PCR技術，檢測Dm-Cu/Zn-SOD在非離子氨和低溶氧脅迫下的表達情況，發(fā)現(xiàn)較低的非離子氨濃度和低溶氧都能誘導Dm-Cu/Z

10、n-SOD基因的表達。本實驗說明，Dm-Cu/Zn-SOD是良好的水域毒理檢測生物標記物，同時也為進一步研究枝角類抗氧化系統(tǒng)的響應機制提供了基礎。
　　5.在藍藻水華積累及降解形成的低溶氧狀況下，枝角類的生長和繁殖受到不同程度的抑制。為了解不同齡期（1、4、7、14天）D.magna對溶解氧急劇變化的耐受性，本研究采用急性毒性實驗方法探討了低溶氧對不同齡期D.magna經(jīng)48小時暴露后存活情況。同時，檢測D.magna體內hemo

11、globin(DHB)、α-esterase(EST)、catalase(CAT)、heat-shock protein70(HSP70)基因受到不同低溶氧脅迫的差異表達。(1)溶氧對不同齡期D.magna48小時存活率影響，結果表明日齡期越大的個體，對低溶氧脅迫越敏感，存活率越低，這可能是由于大齡個體所需的氧氣量要比低齡個體多造成的;(2)不同齡期個體的DHB對溶氧變化的響應模式是相似的:隨著溶氧降低呈顯著性(p＜0.05)“先升后降

12、”趨勢。DHB具有結合氧氣分子并輸送到機體全身的功能，一般情況下，外界溶解氧下降會刺激血球蛋白基因表達量上升，但溶解氧過度下降會抑制血球蛋白表達;(3)不同齡期個體的EST對溶氧變化的響應模式是不同的:1日齡個體EST表達量隨著溶解氧下降而顯著性上升(p＜0.05）;4、7日齡個體EST表達量隨著溶解氧下降呈“先升后降”趨勢(p＜0.05);14日齡個體EST表達量隨著溶解氧下降呈顯著性下降(p＜0.05);(4)不同齡期個體的CAT和