骨髓內(nèi)皮祖細胞移植治療糖尿病模型大鼠周圍神經(jīng)病變的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病是由多種病因引起的一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，其并發(fā)癥對人體造成的危害很大。糖尿病神經(jīng)病變，尤其是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)，是最常見的糖尿病并發(fā)癥之一。在DPN的諸多因素中，氧化應激和血管受損起著至關重要的作用。諸多研究表明，改善氧化應激狀態(tài)和修復受損的血管有利于神經(jīng)病變的恢復。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells

2、，EPCs)作為一種干細胞，具有分化成血管內(nèi)皮細胞且參與新血管形成的功能。研究表明，EPCs數(shù)量的減少和功能受損與血管功能受損密切相關。應用EPCs移植能有效修復受損血管、治療缺血性疾病。EPCs移植對糖尿病神經(jīng)病變是否有效，是否改善氧化應激且有益于神經(jīng)修復尚缺乏足夠研究。目前，該領域研究是國內(nèi)外學者關注的熱點問題。
　　目的:
　　采用大鼠骨髓EPCs移植治療糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)病變，移植前后測定坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度

3、（motor nerve conduction velocity，MNCV）、觀察坐骨神經(jīng)病理學變化并檢測核轉錄因子κB（nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB）及髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)的表達，評價EPCs移植治療DPN的療效并探討其機制。
　　方法:
　　1大鼠骨髓EPCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　1.1大鼠骨髓EPCs的分離與培養(yǎng)

4、
　　用密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離單個核細胞，用培養(yǎng)基將細胞重懸后接種于用人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。
　　1.2大鼠骨髓EPCs的鑒定
　　用雙熒光染色法和matrigel凝膠成血管實驗鑒定EPCs。
　　2 DPN模型大鼠的制備
　　雄性SD大鼠，體重220-240g，適應性喂養(yǎng)7天后禁食12小時，次日用1％鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)一次性大量腹腔注射制備糖尿病模型

5、大鼠，72小時后針刺尾尖取血測空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L為糖尿病造模成功的標準。在用STZ造糖尿病模型前我們測定10只血糖正常大鼠的坐骨神經(jīng)MNCV，糖尿病大鼠分別在4、8、12周時取10只測定其坐骨神經(jīng)MNCV。與血糖正常大鼠相比，當糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)MNCV減慢，差異有統(tǒng)計學意義時，我們認為DPN模型大鼠造模成功。
　　3實驗分組
　　NC組:血糖正常大鼠（10只）
　　A組:DPN模型大鼠（10只）

6、
　　B組:DPN模型大鼠+生理鹽水(10只)
　　C組:DPN模型大鼠+EPCs(10只)
　　4移植體外培養(yǎng)的EPCs
　　C組大鼠成糖尿病模型12周時，收集從正常大鼠骨髓中提取并培養(yǎng)至第7天的EPCs，用生理鹽水溶解后沿坐骨神經(jīng)肌肉注射1ml（含1×106個細胞）;B組大鼠成糖尿病模型12周時沿坐骨神經(jīng)注射等量生理鹽水。
　　5坐骨神經(jīng)MNCV的測定
　　NC組和A組在糖尿病12周時，B組和C組

7、在移植治療4周時測定MNCV。方法:用10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉大鼠后，暴露其坐骨神經(jīng)，用NTS-2000肌電圖與誘發(fā)電位儀測定坐骨神經(jīng)MNCV。
　　6坐骨神經(jīng)病理學標本的制備
　　NC組和A組在糖尿病12周時，B組和C組在移植治療4周時制備病理學標本。
　　方法:制備HE染色標本和電鏡標本，在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)的病理學改變。
　　7坐骨神經(jīng)中NF-κB和MBP的測量
　　NC組

8、和A組在糖尿病12周時，B組和C組在移植治療4周時檢測NF-κB和MBP的表達。方法:用免疫組織化學法在光學顯微鏡下觀察大鼠坐骨神經(jīng)中NF-κB和MBP的表達。
　　結果:
　　1用密度梯度離心法在體外成功分離培養(yǎng)獲得大量EPCs。
　　2糖尿病12周時大鼠的坐骨神經(jīng)MNCV較血糖正常大鼠明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3坐骨神經(jīng)MNCV與NC組相比，A組和B組的MNCV明顯減慢，有統(tǒng)計學差異(

9、P＜0.01);C組的MNCV與NC組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4 HE染色結果A組:神經(jīng)纖維數(shù)量減少，髓鞘薄厚不均并出現(xiàn)空泡變性，軸索變細;B組:神經(jīng)纖維數(shù)量進一步減少，髓鞘薄厚嚴重不均并出現(xiàn)嚴重空泡變性，軸索變細甚至消失;C組:髓鞘薄厚不均、空泡變性及軸索變性均較B組減輕，但較A組嚴重。
　　5電鏡結果A組:髓鞘薄厚不均，部分板層分離，呈彎曲扭轉狀態(tài)，部分增生到軸索內(nèi)，軸索變細:雪旺細胞細胞器變性，染色質凝集，

10、核膜不完整。B組:髓鞘薄厚嚴重不均，板層消失范圍更大，高度彎曲扭轉，軸索變細甚至閉鎖;雪旺細胞細胞器進一步變性甚至消失，染色質凝集甚至核固縮，核膜不完整;C組:髓鞘薄厚不均情況較輕，板層結構大部分存在;雪旺細胞細胞器基本正常，核膜完整，染色質呈凝集狀態(tài)。
　　6 NF-κB表達情況與NC組相比，A組坐骨神經(jīng)中NF-κB表達增加，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);C組NF-κB表達量較A組減少(P＜0.05)，但仍高于NC組(PPA＜0

11、.01，PIOD＜0.05)。
　　7 MBP表達情況與NC組相比，A組坐骨神經(jīng)中MBP表達減少，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);C組MBP表達量與A組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但較B組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結論:
　　1糖尿病模型大鼠成模12周后能成功構建DPN模型大鼠;
　　2 EPCs移植能改善DPN模型大鼠的坐骨神經(jīng)MNCV、脫髓鞘及軸索萎縮等病理學改變;
　　3 EP