新型納米催化劑的設計及用于特定細胞與細胞中重要小分子的檢測.pdf

1、細胞是生物體形態(tài)結構和生命活動的基本單元。在細胞中存在著一些具有特殊生理功能的活性小分子物質(zhì)，如H2O2、 O2等;它們在細胞生物過程中的作用與其在細胞內(nèi)的含量密切相關。如當細胞中H2O2濃度較低時，它參與細胞信號轉導、多種因子細胞生物學效應的啟動，并且控制細胞的增殖、分化與凋亡等;而當其高濃度較高時，則會引起細胞膜脂質(zhì)過氧化、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的變性、DNA的損傷等，進而造成細胞的死亡、機體的炎癥、甚至心血管疾病、神經(jīng)元退變及腫瘤疾病的

2、發(fā)生。因此，對細胞內(nèi)一些重要活性小分子進行實時、動態(tài)的檢測不僅能幫助我們從分子水平理解它們介導生理過程的機制，而且能夠有助于揭示這些活性小分子與人類相關疾病之間的內(nèi)在規(guī)律。電化學方法具有響應快、專一性強和操作簡單等優(yōu)點，成為細胞中一些活性小分子檢測的常用技術手段，該方法不僅能夠準確測量細胞中活性小分子的含量，更能實時監(jiān)測活性小分子從細胞中向胞外釋放的動力學過程。而掌握納米材料的電催化特性，尤其是理解檢測對象在納米電催化劑表面氧化還原反應

3、的機制，從而選擇合適的納米材料構建具有高電催化活性的表界面，能夠極大程度提高電化學檢測方法的靈敏度與專一性。
　　本論文制備了一系列納米電催化劑，研究了細胞中H2O2含量的電化學檢測方法、細胞中H2O2的釋放過程動力學以及細胞中H2O2的胞吐過程等;本論文還用密度泛函理論(DFT)闡明了H2O2和O2分子在納米電催化劑（如氮摻雜石墨烯及石墨炔等）表面的電催化還原反應的機制。本論文的主要內(nèi)容及結果如下:
　　1.制備了辣根過氧

4、化物酶-凹土(HRP-Atta)納米復合催化劑并將其應用于巨噬細胞RAW264.7中H2O2含量的電化學檢測。利用物理吸附法將HRP固定到凹土表面制備得到HRP-Atta納米復合催化劑，用透射電鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、紅外光譜(FTIR)、紫外-可見光譜(UV-vis)、圓二色光譜(CD)等對其進行了表征，研究結果表明，HRP分子能夠通過靜電作用成功吸附在凹土表面并能很好地維持其天然的空間結構。電化學實驗結果表明，HRP分

5、子在凹土表面能夠進行有效的直接電子轉移反應，其伏安曲線上呈現(xiàn)出一對良好的氧化還原峰，氧化峰電位(Epa)和還原峰電位（Epc）分別為-295和-360 mV(vs.SCE，100 mV/s);進一步的研究結果表明，HRP-Atta納米復合催化劑對H2O2的電化學還原反應具有良好的催化性能，對H2O2的定量測定具有響應速率快(2 s)、線性范圍寬(0.2-150μmol/L)、靈敏度高（55.8±2.9μA L/mmol cm2）及檢測限

6、低(0.05±0.01μmol/L)等優(yōu)點。將HRP-Atta復合催化劑應用于RAW264.7細胞中H2O2含量的電化學檢測，結果表明該復合物可以準確地測定細胞中H2O2的含量為（0.29±0.05）mmol/L，并且不受細胞內(nèi)其他活性氧物質(zhì)(ROS)和電活性物質(zhì)如OCl-和抗壞血酸等的干擾。
　　2.建立了一種制備氮摻雜石墨烯(N-graphene)的簡單方法。該方法以水合肼為還原劑，在水熱條件下一步實現(xiàn)氧化石墨烯的還原及氮原子

7、的摻雜從而制備得到N-graphene。利用TEM、AFM、FTIR、拉曼光譜（Raman）和X-射線光電子能譜(XPS)等對制備的N-graphene進行了表征。結果表明，所得到的N-graphene具有單層結構，N元素含量為4.5％，其中吡啶型N、吡咯型N、石墨型N及氧化吡啶型N分別為28％、49％、19％及4％。循環(huán)伏安實驗結果表明N-graphene對H2O2電化學還原具有高的催化活性，還原起峰電位分別比不摻雜的石墨烯及玻碳正移

8、了230和280mV，還原電流密度也分別比不摻雜的石墨烯及玻碳提高到2倍和25倍。將N-graphene應用于活細胞如嗜中性粒細胞、RAW264.7細胞及人乳腺癌細胞MCF-7中H2O2的電化學監(jiān)測，結果表明N-graphene具有良好的生物相容性及高的穩(wěn)定性，能用于細胞中H2O2釋放動力學及不同外界刺激條件下細胞胞吐過程的研究。
　　3.利用DFT方法研究了N-graphene中N摻雜微觀構型對H2O2電還原反應催化活性的影響。

9、分別研究了H2O2在石墨烯、吡啶型N-graphene、吡咯型N-graphene及石墨型N-graphene表面的吸附以及電催化還原過程的機制。結果表明;H2O2在石墨烯及N-graphene表面的吸附過程屬于弱的物理吸附，而當反應體系中引入質(zhì)子和電子后，一系列化學反應隨之發(fā)生，包括H2O2分子中的O-O鍵的斷裂、-OH的生成、-OH以C-O鍵的形式在石墨烯及N-graphene表面的化學吸附及兩個H2O分子的生成。對H2O2還原的反

10、應能及還原反應每個步驟的可逆電勢進行了計算;結果表明，H2O2在石墨烯及N-graphene表面的電還原反應為自發(fā)的反應過程，并且石墨烯納米催化劑對H2O2還原反應的電催化活性順序為吡啶型N-graphene＞吡咯型N-graphene＞石墨型N-graphene＞石墨烯。我們還從靜電勢及最高占有軌道(HOMO)與最低空未占軌道(LUMO)之間能級差的角度就N摻雜構型對H2O2電還原反應催化活性的影響規(guī)律進行了解釋。
　　4.采用

11、DFT方法研究了新型二維碳材料石墨炔表面的氧氣電催化還原反應(ORR)的機制。我們首先對石墨炔的構型進行了優(yōu)化，并對其表面的電荷分布進行了分析，發(fā)現(xiàn)石墨炔結構中的碳原子分別以sp-及sp2-雜化狀態(tài)的C≡C及C=C鍵模式存在，其表面電荷分布明顯不均勻，存在大量的帶有正電荷的碳原子，能夠為O2及OOH+分子的吸附及催化反應提供多個位點。我們還對石墨炔表面的ORR反應機制進行了研究;結果表明，O2及OOH+分子在石墨炔表面通過C-O化學鍵形

12、成了有效的化學吸附，吸附能分別為-1.48 eV和-4.28 eV，并且在石墨炔表面發(fā)生了O-O鍵的斷裂從而實現(xiàn)了4電子的還原反應;我們通過反應能及可逆電勢的計算證明了石墨炔表面的ORR反應屬于自發(fā)的放熱反應，說明石墨炔對ORR反應具有高的電催化活性，并從HOMO-LUMO之間能級差的角度對石墨炔具備的高催化活性進行了解釋。
　　5.制備了適配體-Ag-Au納米復合物（aptamer-Ag-Au），并將其應用于人乳腺癌細胞的拉曼（

13、Raman）檢測及近紅外光療。用光還原法以核酸適配體S2.2為模板合成了aptamer-Ag-Au納米復合物，并用UV-vis及TEM對其進行了表征。相差(DIC)、熒光、Raman光譜及TEM結果表明，制備的納米復合物可以通過S2.2和MCF-7細胞膜表面的粘蛋白MUC1之間的特異性作用結合在MCF-7細胞表面，從而特異性地識別MCF-7細胞，而該復合物與其他類型的腫瘤細胞（如人肝癌細胞HepG2）或正常乳腺上皮細胞MCF-10A等不

14、能發(fā)生特異性結合。制備的aptamer-Ag-Au復合物還具有高的表面增強拉曼(SRER)活性，其Raman增強因子能夠達到106，因此可以應用于MCF-7細胞的高靈敏及高特異性Raman檢測。進一步將所制備的aptamer-Ag-Au應用于MCF-7細胞的光熱治療，研究結果表明，aptamer-Ag-Au復合物能吸收近紅外光并將光能轉化為熱能傳遞給靶細胞MCF-7，在功率0.25 W/cm2的近紅外光光照1h能有效地將MCF-7細胞的