不對(duì)稱雙層膜高分子囊泡.pdf

1、本研究揭示了一種全新的藥物載體系統(tǒng)——不對(duì)稱雙層膜高分子囊泡（polymersomeofasymmetricbilayermembrane）以及構(gòu)建這一載體系統(tǒng)的新方法—相導(dǎo)向自組裝(phase-guidedselfassembly)。不對(duì)稱膜高分子囊泡為生物大分子藥物以自然形態(tài)實(shí)現(xiàn)納米或亞微米包封，這一至今仍困擾著本領(lǐng)域科學(xué)家的難題提供了合理的解決方案，而相導(dǎo)向自組裝則為自組裝載體的表面生物功能化提供了簡便易行的方法。
　　高分

2、子囊泡的問世為構(gòu)建包封生物大分子的納米及亞微米聚合物載體提供了新的思路。高分子囊泡是由兩親嵌段共聚物分子形成的雙層膜構(gòu)成的囊泡，在結(jié)構(gòu)上與脂質(zhì)體類似，但機(jī)械強(qiáng)度遠(yuǎn)大于脂質(zhì)體，且高分子嵌段的化學(xué)組成可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)與合成。目前報(bào)道的高分子囊泡多數(shù)以聚乙二醇(PEG)為親水端，其對(duì)生物大分子的包封基于動(dòng)力學(xué)上的隨機(jī)性，包封率很低;更不利的是PEG嵌段對(duì)蛋白分子的水力學(xué)排斥作用（hydrodynamicrepulsion）過大，導(dǎo)致蛋白的包封

3、率進(jìn)一步降低（文獻(xiàn)報(bào)道只有5％）。另外，水力學(xué)排斥的親水環(huán)境同樣會(huì)對(duì)蛋白藥物產(chǎn)生變性與聚集的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力，這一熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力在劑型凍干保存時(shí)將隨著降溫過程而加劇。
　　針對(duì)這些問題并且受到常規(guī)高分子囊泡的啟發(fā)，我們利用聚乙二醇(PEG)和葡聚糖(DEX)的不同的物理化學(xué)性質(zhì)，采用兩種不同的嵌段高分子PEG-PCL和DEX-PCL，成功地構(gòu)建了不對(duì)稱雙層膜的高分子囊泡，即一種嵌段高分子(DEX-PCL)選擇性地形成內(nèi)膜，而另一種嵌段高

4、分子(PEG-PCL)選擇性地形成外膜。這種新型的高分子囊泡具有熱力學(xué)上不同的內(nèi)外環(huán)境，囊泡的內(nèi)水相是對(duì)蛋白友好的葡聚糖相，囊泡外則是排斥蛋白的PEG相，因此，可以通過分配率(KP)將蛋白熱力學(xué)包封于囊泡的內(nèi)水相，從而使包封率大幅度提高到90％，同時(shí)降低蛋白的自由能（△G=-RTlnKp），提高了蛋白的穩(wěn)定性。
　　本研究設(shè)計(jì)的構(gòu)建不對(duì)稱膜高分子囊泡的方法——相導(dǎo)向自組裝，利用了親水高分子因混合熵小而形成親水兩相區(qū)的原理，結(jié)合兩親

5、嵌段共聚物分子的特點(diǎn)，讓不同的嵌段高分子聽從指揮，不發(fā)生混合而選擇性地形成內(nèi)外雙層膜，顯示了自組裝上的美妙之處。制備過程中，將預(yù)先設(shè)計(jì)合成的分別以PEG和DEX為親水端的兩種嵌段共聚物，加入PEG和葡聚糖形成的水-水乳溶液中，由于PEG和葡聚糖的不相容性，以DEX為親水嵌段的兩親分子(DEX-PCL)在水-水乳兩相的界面排列，DEX嵌段指向分散相葡聚糖相，而以PEG為親水嵌段的兩親分子(PEG-PCL)則是PEG嵌段指向連續(xù)向PEG相;

6、它們的疏水端則由于疏水性相互作用，交叉排列形成囊泡的疏水層，從而形成具有不對(duì)稱雙層膜結(jié)構(gòu)的高分子囊泡。
　　本文首先合成了一系列的具有不同親水嵌段比例(f)的兩親嵌段共聚物PEG-PCL和DEX-PCL，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并首次系統(tǒng)研究了不同fDEX的DEX-PCL在水溶液中的自組裝行為，為不對(duì)稱膜高分子囊泡的構(gòu)建奠定了重要的理論基礎(chǔ)。
　　在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)了四個(gè)實(shí)驗(yàn)（宏觀相分離速度實(shí)驗(yàn)、嵌段共聚物在水-水乳中的分配實(shí)

7、驗(yàn)、粒徑和共聚物加入量的關(guān)系實(shí)驗(yàn)和2D-NOESY-NMR的表征實(shí)驗(yàn)），證明了高分子囊泡的不對(duì)稱雙層膜結(jié)構(gòu)。
　　不對(duì)稱膜高分子囊泡不僅有較高的包封率，而且能夠很好的保持蛋白的穩(wěn)定性。被包封進(jìn)高分子囊泡的BSA蛋白在60℃下水浴6h，SEC-HPLC實(shí)驗(yàn)表明，蛋白的聚集率基本沒有變化。將不對(duì)稱膜高分子囊泡包封進(jìn)PLGA微球中，SEM結(jié)果顯示，可以得到形態(tài)圓整、粒徑均勻的復(fù)合微球。釋放實(shí)驗(yàn)表明，微球中BSA蛋白的釋放接近零級(jí)控釋，基

8、本沒有突釋現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)表明不對(duì)稱膜高分子囊泡可以很好的改善微球的釋放動(dòng)力學(xué)。
　　針對(duì)不對(duì)稱膜高分子囊泡對(duì)滲透壓耐受性較差的問題，合成了可交聯(lián)的甲基丙烯酸縮水甘油酯衍生化的葡聚糖(GMA-Dextran)，采用內(nèi)水相原位交聯(lián)的方法來穩(wěn)定囊泡的結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該囊泡的穩(wěn)定性大大提高，可以經(jīng)受滲透壓的突變（如稀釋10倍以上）而保持雙層膜結(jié)構(gòu)的完整性。
　　實(shí)驗(yàn)中以促紅細(xì)胞生成素(EPO)為模型蛋白，考察了蛋白藥物在高分子囊泡中的釋

9、放動(dòng)力學(xué)和釋放后的生物活性。我們得到了一致性很高的蛋白累積釋放曲線和UT-7細(xì)胞增殖曲線，說明蛋白的生物活性在高分子囊泡中得到了很好的保持。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在PEG/GMA-Dextran溶液的單相區(qū)加入交聯(lián)劑，在激光動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)下可以檢測到納米級(jí)的粒子，說明交聯(lián)后發(fā)生微相分離、析出葡聚糖球。采用新發(fā)現(xiàn)的交聯(lián)微相分離的方法，可以制備300-1200nm的亞微米級(jí)的不對(duì)稱膜高分子囊泡，并采用DLS和透射電鏡(TEM)對(duì)亞微

10、米級(jí)的不對(duì)稱囊泡進(jìn)行了表征。包封BSA蛋白的納米級(jí)的不對(duì)稱膜囊泡的釋放實(shí)驗(yàn)表明，其釋放曲線較好，釋放時(shí)間可持續(xù)35h。
　　本文研究結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的相導(dǎo)向自組裝的方式可以成功的制備具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的高分子囊泡，這種新的不對(duì)稱雙層膜高分子囊泡能夠顯著提高蛋白等生物大分子的包封率，保持結(jié)構(gòu)脆弱的蛋白大分子的生物活性;通過調(diào)節(jié)制備條件，可以制備從納米級(jí)到微米級(jí)一系列大小的不對(duì)稱膜高分子囊泡;對(duì)蛋白藥物的釋放曲線表明它具有良好的釋放動(dòng)力學(xué)