小麥高效PGPR菌的篩選鑒定及多色FISH檢測促生菌在根部的定殖.pdf

1、本實驗篩選和鑒定了高效的具有特異親和性的小麥根際促生菌并研究小麥根際菌在根部的定殖動態(tài)。通過使用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小麥凝集素為介導工具篩選小麥根際促生菌。共獲得32株與小麥凝集素具有親和性染色的高效根際菌，分別為固氮菌17株，解磷細菌4株，解鉀細菌11株。通過生理生化鑒定，大部分菌落呈白色和乳白色，WS17菌株的菌落顏色呈蛋黃色。17株菌為革蘭氏陰性菌，15株菌為革蘭氏陽性菌，31菌菌具有接觸酶的活性。其中，27株菌具有淀

2、粉酶活性，有3株菌的M.R.實驗呈陽性，4株菌的V.P.實驗呈陽性，有9株菌可以產(chǎn)硫化氫，8株菌能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸。大部分菌株可以利用單糖和多糖為唯一碳源。對篩選獲得的代表菌株進行了16S rRNA基因序列的分析和構建系統(tǒng)進化樹。進化樹主要由芽孢桿菌、假單胞菌和節(jié)桿菌等7個種屬構成組成。其中最主要的類群是芽孢桿菌屬(Bacillus)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。
　　 根際促生菌具有促生特性，對植物的生長具有重要作用

3、，因此鑒定和分析32株菌的促生特性，如產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體、溶磷活性和抑制霉菌的能力是獲得高效根際菌的重要參考指標。篩選獲得的32株中，有21(65.6％)株菌產(chǎn)吲哚乙酸，其中3株菌的產(chǎn)量超過80mg/1，菌株WS12產(chǎn)量最高為103.3mg/1。鐵載體的檢測采用平板法和液體培養(yǎng)法。32株菌在采用平板法檢測時，只有5株菌具有鐵載體活性，表現(xiàn)為菌落周圍有黃色暈圈。采用液體培養(yǎng)法時，產(chǎn)鐵載體菌株的培養(yǎng)基顏色變成淡黃色。通過使用CAS反應檢測，

4、19(59.3％)株菌可以產(chǎn)鐵載體，12株菌的產(chǎn)量達到5+的水平。說明采用液體培養(yǎng)測定菌株的產(chǎn)鐵載體活性更具靈敏性。平板法可能由于使用的產(chǎn)鐵載體固體培養(yǎng)基對細菌生長具有一定的抑制作用。31(96.8％)株菌株具有溶磷活性，溶磷能力在9.38.57.5μg/ml之間，其中菌株WS31溶磷活性最高為57.77±1.03μg/ml。雖然這些菌株篩選自不同培養(yǎng)基，但均具有溶磷活性。檢測了32株菌抑制植物病原真菌的能力，發(fā)現(xiàn)大部分菌株不具備抑制能

5、力，菌株WS07對4種具有明顯的抑制作用。菌株WS07對小麥赤霉病(Fusarium Graminearum)抑制率最大，達到51.40％，對棉花枯萎病菌(F.oxysporum)和玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)，分別為41.03％和39.32％，對水稻紋枯病菌(Phizoctonia solani)的抑制作用達到37.7％。因此菌株WS07表現(xiàn)出較好的抑制植物病原真菌的效果。測定菌株的促生長特性對微生物肥料的開發(fā)和應

6、用具有重要的研究價值。
　　 采用大試管培養(yǎng)法測定了32株菌對小麥幼苗早期生長的影響。結果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的菌液對小麥的生長具有顯著性的促進作用。其中21株菌明顯促進小麥次生根的生長；22株菌對小麥的株高具有促進作用；23株菌可以促進小麥的根長。接種32株菌，有11株菌對小麥的莖鮮重具有促進作用。17株菌增加了小麥的根鮮重。10株菌增加小麥莖干重，19株增加小麥根干重。在32株菌株中對小麥的主根數(shù)、側根數(shù)、株高、根長、總鮮重、根鮮

7、重、莖干重和根干重具有促進作用的比例分別達到15.62、65.62、68.75、71.87、34-37、53.12、31.25和59.37％；上述的促進作用均在p=0.05水平上達到顯著性差異。菌株促生作用主要表現(xiàn)在明顯提高小麥生長的幾個主要指標，如小麥的側根數(shù)、株高、根長和根干重等。將促生結果與細菌的生理活性進行比較，發(fā)現(xiàn)若細菌(65.6％)具有越多種類的促生生理活性，則越多種類的小麥生長指標得到顯著提高，說明細菌的促生生理活性對植物

8、的生長具有重要的促進作用?？疾旒毦鷮π←溕L的促進作用可以為微生物肥料的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。
　　 通過使用電轉化法將質粒pTR102轉入菌株WS32中，用于研究該菌株在小麥根表的吸附情況。電轉化轉移頻率為3.55×10-5～4.14×10-5，獲得的標記菌株WS32-L具有發(fā)光活性和tet、km和ch1三種抗性，菌株WS32-L的luxAB基因標記的丟失率為19.7％，說明luxAB基因具有穩(wěn)定遺傳的特性。因此，在根際微生物的研

9、究中可使用luxAB基因標記技術來獲得具有抗性且易檢測的菌株，進而更有效地研究根際微生物在植物根部的定殖過程。
　　 細菌吸附于小麥根表是形成定殖的必要條件，因此菌株WS32-L被用來研究在小麥根表的吸附動力學過程。菌株WS32-L在接觸小麥幼根的瞬間就開始吸附，在60min內達到吸附的飽和值7.85±0.0841gCFU/g。WS32-L在小麥幼根的吸附符合等溫吸附曲線。經(jīng)計算WS32-L在小麥幼根的最大吸附量為6.4.7×1

10、08 CFU/g，吸附系數(shù)α=4.5×10-9。小麥幼根經(jīng)過小麥凝集素的處理后可以提高菌株WS32-L在小麥根部的吸附量，與對照相比較差異達到顯著性水平(P=0.01)。經(jīng)過熱處理的小麥凝集素失去生理活性，不能提高WS32-L在小麥根表的吸附量。由此可見，小麥凝集素在細菌吸附過程中具有重要介導的作用。研究細菌吸附于小麥根表的過程對理解微生物在植物根部的定殖具有指導意義。
　　 FISH是研究根際微生物有效的檢測技術。設計種屬特異

11、性探針，研究了根際促生菌(Bacillus sp.WS24.和Pseudomonas sp.WS32)在小麥根表的定殖動態(tài)。設計的探針具有種屬特異性，可檢測到目的菌株。使用溶菌酶處理芽孢桿菌WS24菌株提高了FISH撿測的靈敏度。在不同菌株混合存在的條件下，不同的種屬探針可以同時檢測多個目標菌株。采用FISH檢測目的菌株在小麥根表定殖，發(fā)現(xiàn)大量菌體吸附在小麥根表和根毛部位，菌體沿根表細胞間隙縱向分布形成致密的生物膜；其中根毛區(qū)的細菌密度