微生物生態(tài)學(xué)研究中通用引物的覆蓋率評(píng)估以及高通量測(cè)序結(jié)果的自動(dòng)化處理.pdf

1、微生物群落結(jié)構(gòu)是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容，分子生物學(xué)方法的應(yīng)用使得對(duì)環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的研究成為了可能，促使微生物生態(tài)學(xué)研究從基于培養(yǎng)的時(shí)代進(jìn)入了分子生物學(xué)的時(shí)代。在分子生物學(xué)時(shí)代，我們面臨的問(wèn)題主要有兩個(gè)，一個(gè)是如何無(wú)偏差的從環(huán)境樣品中獲得序列數(shù)據(jù)，另一個(gè)是如何快速、有效地從序列數(shù)據(jù)中提取有價(jià)值的信息。
　　序列數(shù)據(jù)的獲得主要通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR)進(jìn)行，通過(guò)PCR技

2、術(shù)可以直接從總的環(huán)境樣品中選擇性擴(kuò)增特定的基因片段，從而對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。但是PCR過(guò)程中的很多因素都會(huì)導(dǎo)致有偏向性的PCR擴(kuò)增，其中引物的偏向性會(huì)引起部分微生物類型的選擇性擴(kuò)增，導(dǎo)致該方法得到的微生物群落結(jié)構(gòu)和真實(shí)情況出現(xiàn)偏差。全面理解各種通用引物的覆蓋率對(duì)于正確闡釋PCR結(jié)果具有重要作用。之前關(guān)于引物覆蓋率的研究基本上都是定性或半定量的，所用數(shù)據(jù)多來(lái)自RDP等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，這些數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列很多是通過(guò)PCR方法得到的，數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)

3、已經(jīng)受到PCR引物的影響。而且之前的研究也沒(méi)有考慮引物和模板之間不同位置的錯(cuò)配對(duì)覆蓋率的影響，尤其是引物3'端的4位堿基所發(fā)生的錯(cuò)配。
　　本研究對(duì)目前微生物生態(tài)學(xué)研究中面臨的兩個(gè)問(wèn)題都進(jìn)行了初步的研究。首先在RDP數(shù)據(jù)集和7個(gè)元基因組數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)上對(duì)8個(gè)常用的細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行了非覆蓋率的評(píng)估。在域的水平，每個(gè)引物在8個(gè)元基因組數(shù)據(jù)中的非覆蓋率平均值都比相應(yīng)引物在RDP數(shù)據(jù)中的非覆蓋率值要高，除27F外，其它引

4、物的該比值都在4以上，對(duì)于519R來(lái)說(shuō)這個(gè)比值高達(dá)11.5。在門(mén)的水平，引物末4位堿基的單錯(cuò)配(single mismatch)對(duì)非覆蓋率顯示出重要影響，尤其是對(duì)338F和519F這兩個(gè)引物，它們使338F在5個(gè)門(mén)以及519F在10個(gè)門(mén)中的非覆蓋率提高了至少20％。對(duì)于每個(gè)引物，我們分析了引起其高非覆蓋率的主要錯(cuò)配類型，以及這些錯(cuò)配類型在各個(gè)門(mén)中的分布，然后在這些錯(cuò)配類型的基礎(chǔ)上通過(guò)引入簡(jiǎn)并堿基或門(mén)特異性的引物序列，對(duì)6個(gè)引物進(jìn)行了改進(jìn)

5、，改進(jìn)后的引物可以覆蓋更廣的細(xì)菌譜。
　　在序列數(shù)據(jù)的處理過(guò)程中，主要問(wèn)題是缺少能夠全面滿足微生物生態(tài)學(xué)研究的系統(tǒng)化、自動(dòng)化的軟件。目前基于序列的微生物生態(tài)學(xué)研究主要分為兩個(gè)階段，一個(gè)是可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，簡(jiǎn)稱OTU)的定義，可以大致提供樣品的微生物多樣性信息;另一個(gè)是序列的生物學(xué)分類，可以提供樣品的微生物種類信息。一般的研究都包括這兩個(gè)過(guò)程，但是現(xiàn)有的軟件基本上都只能完成其中一個(gè)

6、過(guò)程，滿足我們的部分需求，而且大都限于16S rRNA基因序列的處理。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及測(cè)序費(fèi)用的下降，單次研究所要處理的數(shù)據(jù)從幾百條上升到了幾萬(wàn)甚至幾十萬(wàn)條，通過(guò)軟件自動(dòng)化的處理這些數(shù)據(jù)是廣大微生物生態(tài)學(xué)家的共同需求。
　　為了解決數(shù)據(jù)處理過(guò)程中的難題，我們開(kāi)發(fā)了軟件OTU_Misess。OTU_ Misess是一個(gè)整合了序列的OTU定義和生物學(xué)分類的自動(dòng)分析軟件，除了分析細(xì)菌和古生菌的序列(16S rRNA)，還能分

7、析真核生物(18S/ITS)和功能基因的序列，分析過(guò)程主要分為兩個(gè)階段:第一階段是從峰圖文件中讀取堿基，經(jīng)過(guò)序列質(zhì)量和長(zhǎng)度篩選之后去除載體和引物來(lái)源的序列片段，生成有效序列文件;第二階段是對(duì)有效序列進(jìn)行分析，包括OTU定義、微生物分類和末端限制性片段長(zhǎng)度分析(Terminal Restriction Fragment，簡(jiǎn)稱T-RF)。這兩個(gè)過(guò)程可以一起進(jìn)行，也可以分開(kāi)進(jìn)行。一次運(yùn)行可以同時(shí)分析不同樣品來(lái)源的數(shù)據(jù)，并且根據(jù)來(lái)源列出不同樣品

8、的群落組成。通過(guò)對(duì)已發(fā)表文章中的834條16S rRNA基因序列、181條18S rRNA基因序列以及975條ITS基因序列進(jìn)行OTU_Misess分析，并和Greengenes以及RDP的分類結(jié)果進(jìn)行比較，我們證明了OTU_Misess在16S rRNA、18S rRNA以及ITS基因序列分類功能上的可信度。
　　我們的工作對(duì)分子生物學(xué)方法在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用所面臨的兩個(gè)階段的問(wèn)題進(jìn)行了初步研究，為了更深入的解決這些問(wèn)題，