金黃色葡萄球菌中clpP、clpX及SarZ重要致病性基因功能的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是重要的人類致病菌，酪蛋白裂解酶P(clpP)、酪蛋白裂解酶X(clpX)及葡萄球菌附屬調節(jié)子Z(SarZ)是金黃色葡萄球菌中調節(jié)毒力因子的重要蛋白，clpP蛋白和clpX蛋白屬于CLp蛋白水解酶，在生物體蛋白質代謝過程的調節(jié)和清除不可逆損傷蛋白的過程中發(fā)揮重要作用。SarZ蛋白屬于SarA家族蛋白，是一個二聚體的DNA結合蛋白，它能和特異DNA區(qū)域結合來調控hla（溶血素基因）和附屬基因調節(jié)系統(tǒng)(是S.aureus中最早

2、發(fā)現的毒力因子調控因子之一，agr)。MgrA和SarZ蛋白是同系物都屬于SarA家族蛋白，研究發(fā)現MgrAC12、SarA和SarZC13等蛋白分子半胱氨酸是關鍵的酶活中心，通過半胱氨酸的磷酸化修飾引起了蛋白質結構中氫鍵網絡的變化而導致構象的變化，調節(jié)金黃色葡萄球菌毒力因子的產生以及細菌對萬古霉素的抗性，主要研究結果分為兩部分:
　　 1.clpP蛋白水解酶底物研究.利用同源重組原理在newman基因組中成功敲除clpP基因。

3、
　　clpP敲除突變體與野生型相比致病性明顯下降。通過pyj335∷clpP質粒構建，進行基因功能互補實驗，恢復到了野生型。尿素酶瓊脂板結果顯示，尿素酶活性明顯比野生型增加.通過觀察2％牛奶板，發(fā)現胞外蛋白酶活性也增加了。利用紅霉素(erm)抗性標記基因，在newman菌株中進行clpX敲除突變菌株的篩選。利用細菌雙雜交試劑盒，探究clpP和clpX蛋白在細菌體內的相互作用。
　　 2.SarZ蛋白C13的半胱氨酸磷酸

4、化修飾與DNA結合特性及毒力研究.
　　 研究表明在SarZ蛋白的C-、N-末端及螺旋轉角螺旋(winged helix-turn-helixmotif(wHTH)）區(qū)域氨基酸進行一系列的點突變可以改變蛋白與DNA的結合能力。
　　 通過電泳遷移率試驗(EMSA)，發(fā)現SarZ(C13E)突變以后能夠減弱蛋白和DNA的結合能力，而SarZ(C13S)提高了與DNA的結合能力。
　　 牛奶板結果也顯示法對SarZ1

5、3C進行點突變以后能改變蛋白的折疊方式，造成蛋白特性與功能的改變。
　　 SarZ蛋白中存在的半胱氨酸(cys)磷酸化修飾在金黃色葡萄球菌中是一種新的氧化還原蛋白的翻譯后修飾方式。
　　 通過對SarZ蛋白的研究，類推到SarA家族蛋白—MgrA(最近發(fā)現的金黃色葡萄球菌自溶和毒力調控因子)，MgrAC12E進行點突變，研究蛋白結構改變對其功能的影響。ClpP和ClpX蛋白在金黃色葡萄球菌的生理和毒力方面具有重要作用，但