原生質(zhì)體融合提高大豆異黃酮還原菌株耐氧突變株的耐氧能力與有氧轉(zhuǎn)化效率.pdf

1、迄今國內(nèi)外報道的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化菌株均必須在嚴格厭氧條件下才能完成轉(zhuǎn)化功能。為提高大豆異黃酮轉(zhuǎn)化菌株的耐氧特性，本實驗室經(jīng)耐氧馴化，國內(nèi)外首次將嚴格厭氧牛瘤胃細菌菌株Niu-O16馴化成為耐氧突變株Aeroto-Niu-O16，該耐氧突變株在有空氣氧條件下既能生長又能將大豆異黃酮黃豆苷原(Daidzein)和染料木素(Genistein)分別還原為二氫黃豆苷原(Dihydrodaidzein，簡稱DHD)和二氫染料木素（Dihydroge

2、nistein，簡稱DHG）。與野生菌株Niu-O16相比，耐氧突變株Aeroto-Niu-O16的耐氧能力明顯提高，但耐氧突變株Aeroto-Niu-O16在有氧條件下的轉(zhuǎn)化效率則顯著低于野生菌株Niu-O16在厭氧條件下的轉(zhuǎn)化效率。本研究將耐氧突變菌株Aeroto-Niu-O16與動物腸道優(yōu)勢需氧菌進行原生質(zhì)體融合，以進一步提高耐氧突變株Aeroto-Niu-O16的耐氧能力與有氧轉(zhuǎn)化效率。
　　 供試20株不同動物腸道優(yōu)勢

3、需氧菌中，只有來自ICR小鼠腸道的M3、M4、M5和M6以及來自豬腸道的Z5對溶菌酶較為敏感。經(jīng)進一步研究發(fā)現(xiàn)，5株溶菌酶敏感菌株中以來自ICR小鼠腸道的弗氏埃希氏菌株M6的原生質(zhì)體制備率和再生率均最高。因此，以腸道優(yōu)勢需氧菌M6為試材，研究不同菌齡、酶濃度、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑以及添加不同化學組分等對菌株M6原生質(zhì)體制備與再生的影響，確定菌株M6原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。將菌株M6的原生質(zhì)體進行熱滅活后，在PEG介導下與大豆異黃

4、酮轉(zhuǎn)化菌株耐氧突變株Aeroto-Niu-O16進行原生質(zhì)體融合，篩選到一株能在有氧條件下生長并將大豆異黃酮黃豆苷原和染料木素分別高效還原為DHD和DHG的融合子，我們將該融合子命名為AUH-RHZ-1。
　　 融合子AUH-RHZ-1在淀粉水解酶活性及產(chǎn)氫性能上繼承了滅活親本菌株M6的特性，但在菌體形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA序列、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)及酯酶同工酶譜等許多方面則表現(xiàn)出與親本菌株Aeroto-

5、Niu-O16相同或相似特性。值得一提的是，親本菌株Aeroto-Niu-O16在有空氣氧條件下生長時會在其菌體外壁形成一層抗氧化“保護膜”結(jié)構(gòu)，而融合子在相同條件下生長時在其外壁并未檢測到類似的“保護膜”結(jié)構(gòu)。此外，融合子AUH-RHZ-1對甲硝唑、阿奇霉素、慶大霉素等抗生素的耐受性明顯高于雙親菌株。通過對比分析菌體生長過程中培養(yǎng)基氧化還原電位變化動態(tài)、接種量及培養(yǎng)基高度等對菌體生長的影響，發(fā)現(xiàn)融合子AUH-RHZ-1的耐氧能力明顯高