十字花科黑腐病菌十四個(gè)小RNA的功能鑒定.pdf

1、細(xì)菌小 RNA,也稱為非編碼 RNA,是一類大小通常介于50-500nt之間,不編碼蛋白質(zhì),卻具有獨(dú)立功能的RNA分子。小RNA廣泛存在于細(xì)菌以及真核生物中,對(duì)細(xì)胞的生理過程起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,小RNA在細(xì)菌的糖代謝,碳代謝,應(yīng)激反應(yīng),細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和致病性等方面發(fā)揮著重要的作用。近年來,盡管已經(jīng)有將近1000個(gè)細(xì)菌小RNA被鑒定出來,但是,絕大多數(shù)小RNA的生物學(xué)功能尚不清楚。
　　十字花科黑腐病菌(Xanthomonas

2、campestris pathovar campestris,以下簡(jiǎn)稱Xcc)是在世界范圍內(nèi)廣泛引起芥菜、蘿卜、甘藍(lán)和白菜等十字花科植物黑腐病的病原菌,也是病原菌與植物互作的重要模式菌種之一。之前,本課題組采用RNA深度測(cè)序(RNA-seq)方法,在十字花科黑腐病菌8004菌株(Xcc8004)中鑒定了1008個(gè)候選小RNA,其中90多個(gè)小RNA已通過Northern雜交或RT-PCR驗(yàn)證,但它們的功能還不清楚。本研究選取已通過RT-P

3、CR驗(yàn)證的14個(gè)小RNA作為研究對(duì)象,通過構(gòu)建它們的過量表達(dá)株和缺失突變體以及表型分析來確定它們的生物學(xué)功能。
　　由于這14個(gè)目的小RNA轉(zhuǎn)錄方向未知,因此,本研究首先采用鏈特異性RT-PCR對(duì)這14個(gè)小RNA的轉(zhuǎn)錄方向進(jìn)行確定。目前,已經(jīng)確定了12個(gè)小RNA的轉(zhuǎn)錄方向。目的小RNA的轉(zhuǎn)錄方向確定后,緊接著進(jìn)行了過量表達(dá)株和缺失突變體的構(gòu)建。目前,本研究已獲得了所有14個(gè)目的小RNA的過量表達(dá)株和5個(gè)位于基因間隔區(qū)的目的小RNA

4、的缺失突變體。并且還對(duì)這些過量表達(dá)株和缺失突變體的以下表型:(1)在豐富培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)情況、(2)胞外酶活性、(3)胞外多糖產(chǎn)量、(4)金屬離子耐受性、(5)對(duì)蛋白質(zhì)變性劑SDS和NaCl的耐受能力、(6)游動(dòng)性、(7)聚集生長(zhǎng)能力、(8)在寄主植物上的致病力以及在非寄主植物上引起高敏反應(yīng)(HR反應(yīng))的能力;進(jìn)行了檢測(cè),并和野生型菌株和帶有空的過量表達(dá)載體 pBBad18K的野生型菌株的表型進(jìn)行比較。結(jié)果顯示:(1)小RNA

5、sRXcc-40的過量表達(dá)株OE40對(duì)Co2+的耐受性比導(dǎo)入了空的過量表達(dá)載體的野生型菌株(WT/pB)和過量表達(dá)sRXcc-40的反義RNA的菌株OE40R的顯著增強(qiáng);(2)小RNA sRXcc-36的缺失突變體DM36在豐富和基本培養(yǎng)基生長(zhǎng)的穩(wěn)定期的菌體密度比野生型菌株的顯著增高;(3)小RNA sRXcc-35的缺失突變體DM35在基本培養(yǎng)基的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度略高于野生型菌株,(4)其它的過量表達(dá)株和缺失突變體的所有檢測(cè)表