白菜與十字花科黑腐病菌Ⅲ型效應(yīng)物互作蛋白的篩選.pdf

1、白菜(Brassica campestris)是我國(guó)栽培蔬菜中種植面積最大，分布最廣的蔬菜品種。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris，簡(jiǎn)稱Xcc)能夠侵染白菜引起黑腐病，導(dǎo)致白菜產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低。弄清白菜與Xcc相互作用的機(jī)理有利于發(fā)展防治黑腐病的新措施和新藥物。本文通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)與植物病原菌Xcc8004菌株致病相關(guān)Ⅲ型效應(yīng)物相互作用的靶標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步的篩選。在本實(shí)驗(yàn)室

2、前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)7個(gè)Ⅲ型效應(yīng)物基因?qū)?yīng)的十字花科黑腐病菌突變體的致病力降低，選取了這1個(gè)基因XC1210、XC2081、XC2082、XC2995、XC3802、XC3177和XC4273進(jìn)行研究。本研究構(gòu)建了與Xcc8004致病相關(guān)的7個(gè)Ⅲ型效應(yīng)物基因的誘餌表達(dá)載體，分別是pGBKT7-1210、pGBKT7-2081、pGBKT7-2082、pGBKT7-2995、pGBKT7-3177、pGBKT7-3802和pGBKT7-4

3、273，并且分別進(jìn)行了含誘餌質(zhì)粒的酵母菌株Y187自激活檢測(cè)和誘餌質(zhì)粒表達(dá)對(duì)酵母的毒性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)含誘餌質(zhì)粒的酵母Y187沒(méi)有自激活，誘餌質(zhì)粒表達(dá)對(duì)酵母沒(méi)有毒性。構(gòu)建了野生型Xcc8004侵染白菜品種中白-83的cDNA文庫(kù)，用于本研究的酵母雙雜交篩選。cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率為6.2×106個(gè)轉(zhuǎn)化子/3μg pGADT7-Rec，文庫(kù)滴度為2.1×109 pfu/mL，文庫(kù)重組率為96%。
　　 通過(guò)含誘餌質(zhì)粒的酵母菌株Y187和c

4、DNA文庫(kù)的酵母AH109共轉(zhuǎn)化雙雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ⅲ型效應(yīng)物XC1210、XC2081、XC3177、XC3802和XC4273沒(méi)有得到陽(yáng)性克隆子，Ⅲ型效應(yīng)物XC2082和XC2995有陽(yáng)性克隆子。對(duì)雙雜交后的克隆子經(jīng)過(guò)如下步驟進(jìn)行篩選：(1)經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑表型轉(zhuǎn)板檢測(cè)進(jìn)行初步篩選；(2)對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行酵母菌落PCR檢測(cè)以排除重復(fù)克隆子；(3)經(jīng)過(guò)HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定插入序列的存在；(4)將(3)中酶切驗(yàn)證有插入片段的質(zhì)粒測(cè)序，并

5、去除重復(fù)序列；(5)將誘餌質(zhì)粒與相應(yīng)的文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行一對(duì)一的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證和β-半乳糖苷酶活的測(cè)定確定相互作用的存在與強(qiáng)弱后分別得到與XC2082和XC2995互作的陽(yáng)性克隆子11個(gè)和6個(gè)。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析及生物信息學(xué)分析，得到了與Ⅲ型效應(yīng)物XC2082互作的F-box蛋白、天冬氨酸蛋白酶、核酸酶、甘油醛3-磷酸脫氫酶、G蛋白β-蛋白亞基等11種靶標(biāo)蛋白，與Ⅲ型效應(yīng)物XC2995互作的核酸酶、ATP結(jié)合蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶等6種靶標(biāo)蛋白質(zhì)，通