電噴霧質(zhì)譜法定性定量研究細胞色素C及其非共價鍵復(fù)合物.pdf

1、本論文主要采用電噴霧質(zhì)譜法對細胞色素C及其非共價鍵復(fù)合物進行定性和定量研究。因電噴霧質(zhì)譜法具有多電荷能力，所以其在分析大分子物質(zhì)方面有著獨特的優(yōu)勢。此外，電噴霧質(zhì)譜法所具有的快速、特異性、靈敏的特點促使其在眾多學(xué)科和領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。電噴霧質(zhì)譜法作為一種軟電離方式，其對于非共價鍵復(fù)合物的研究有著不可替代的地位。其不僅能夠在比較溫和的條件下保持復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且能夠容易得出非共價鍵復(fù)合物的分子量、化學(xué)計量比等具體信息。
　　

2、 在電噴霧質(zhì)譜法中，待測樣品信號強度受儀器參數(shù)的影響比較明顯。合適的參數(shù)條件不僅要求樣品的信號強度要足夠強，而且還需盡可能選擇較溫和的條件，這樣有助于保持蛋白質(zhì)及非共價鍵復(fù)合物的天然構(gòu)型。本課題考察各個儀器參數(shù)對信號強度的影響，探索獲得了研究細胞色素C復(fù)合物的最佳實驗條件。并且利用改變碰撞電壓的方法，通過二級質(zhì)譜證明了細胞色素C中血紅素與氨基酸殘基的結(jié)合方式是以穩(wěn)定的共價鍵形式存在。
　　 本文選取三類不同的小分子物質(zhì)（皂苷、

3、寡糖和三萜）與細胞色素C混合并運用ESI-MS來檢測是否形成非共價鍵復(fù)合物。通過實驗結(jié)果證明細胞色素C能與皂苷（柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、人參皂苷Re）形成非共價鍵復(fù)合物；根據(jù)皂苷在分子結(jié)構(gòu)上是由寡糖和三萜兩部分構(gòu)成，先后選擇三種寡糖（水蘇糖、綿子糖、麥芽三糖）和三種三萜（甘草次酸、齊墩果酸、熊果酸）與細胞色素C進行混合，根據(jù)質(zhì)譜檢測出結(jié)果顯示三種寡糖都能與細胞色素C形成非共價鍵復(fù)合物；而檢測結(jié)果未觀察到三種三萜與細胞色素C形成的非共價鍵

4、復(fù)合物。上述研究說明在與細胞色素C形成非共價鍵復(fù)合物的過程中，皂苷的有效結(jié)合區(qū)域在寡糖部分而非三萜部分。本課題是已知目前首次采用電噴霧質(zhì)譜法研究寡糖作為配體與細胞色素C形成的非共價鍵復(fù)合物，證明了電噴霧質(zhì)譜法在對細胞色素C及其非共價鍵復(fù)合物的研究方面所具有的獨特優(yōu)勢，而且為細胞色素C非共價鍵復(fù)合物的配體選擇方面提供了新的思路。
　　 本課題不但通過定性研究證明了皂苷和寡糖都能與細胞色素C形成非共價鍵復(fù)合物，而且通過特定的直接計算

5、法對所形成的非共價鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性進行了定量計算。本課題中采用特定的直接計算法，計算出皂苷（柴胡皂苷A、柴胡皂苷C、人參皂苷Re）、寡糖（水蘇糖、綿子糖、麥芽三糖）分別與細胞色素C形成的1:1、1:2非共價鍵復(fù)合物的解離常數(shù)Kd1、Kd2，并根據(jù)解離常數(shù)大小比較了皂苷、寡糖分別與細胞色素C形成非共價鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性的相對大小。
　　 本課題通過直接實驗法來探究細胞色素C與配體分子的結(jié)合部位和作用方式；根據(jù)計算所得的解離常數(shù)，并結(jié)

6、合配體結(jié)構(gòu)和已知的文獻，我們對于各種配體形成非共價鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性差別給予了詳細、明確的解釋。根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果和配體的結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的參考文獻，得知配體與細胞色素C是以氫鍵的形式形成了非共價鍵復(fù)合物。配體分子中羥基的個數(shù)對非共價鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性具有重要的正相關(guān)性；此外，配體結(jié)構(gòu)以及空間位阻對于非共價鍵復(fù)合物的形成也是有一定的影響。
　　 不同于文獻報道的理論計算法，本實驗課題采用細胞色素C作為模型分子進行電噴霧質(zhì)譜檢測，并選擇配體