利用基因工程技術(shù)提高青蒿中青蒿素含量的研究.pdf

1、青蒿素是從青蒿（Artemisia annua L.）植株的地上部分提取的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯，是目前最有效的治療瘧疾的藥物。由于人工合成青蒿素的難度大，目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取。而青蒿中青蒿素的含量很低（約0.01％-1％），使得青蒿素的市場供應(yīng)能力受到了限制。因此，利用代謝工程提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。 為了提高青蒿素的產(chǎn)量，本研究從兩個方面進(jìn)行：一是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在轉(zhuǎn)基因青蒿中過量表達(dá)

2、青蒿素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因。二是利用植物激素ABA來處理青蒿植株。同時，為了深入研究cyp71av1基因的表達(dá)調(diào)控，本研究對它的啟動子進(jìn)行了克隆，并進(jìn)行了初步的分析。本研究得到了如下結(jié)果： （1）構(gòu)建了青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)載體。 （2）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化青蒿葉片，獲得了系列的轉(zhuǎn)基因青蒿，包括25株轉(zhuǎn)fps基因的青蒿、43株轉(zhuǎn)ads基因的青蒿、10株共轉(zhuǎn)fps和ads基因的青蒿、38株共轉(zhuǎn)hmgr和fps

3、基因的青蒿以及20株共轉(zhuǎn)cyp71av1和cpr基因的青蒿。 （3） Southern blot分析結(jié)果表明外源DNA整合到青蒿基因組中。 （4）用HPLC-ELSD測定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量，從轉(zhuǎn)不同基因的青蒿中均篩選出了青蒿素含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因青蒿株系。其中，轉(zhuǎn)ads基因、轉(zhuǎn)fps基因、共轉(zhuǎn)ads和fps基因、共轉(zhuǎn)hmgr和fps基因以及共轉(zhuǎn)cyp71av1和cpr基因的青蒿中，青蒿素含量最高的株系中青蒿素含量分別

4、為對照的1.8、2.2、2.0、1.8和2.4倍。 （5）用三種不同濃度ABA溶液（1 μM、10 μM、100 μM）處理青蒿植株，使得青蒿素的含量顯著的提高。其中10 μM ABA溶液的效果最好，能夠使青蒿素的含量提高65％。 （6）用10 μM ABA處理青蒿植株和懸浮細(xì)胞，研究了青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)的變化情況，發(fā)現(xiàn)hmgr、fps、cyp71av1和cpr基因的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)。 （7）克隆了cyp