基于磁球技術(shù)的DNA單分子的體積放大以及電化學(xué)檢測.pdf

1、本論文分為二章，第一章是基于體積放大技術(shù)的DNA單分子目視檢測；第二章是基于納米磁球介導(dǎo)酶聯(lián)DNA單分子電化學(xué)檢測。 第一章提出了一種簡單的基于體積放大技術(shù)的DNA單分子檢測方法。該方法分為三步：首先利用生物素與鏈霉親和素的特異性反應(yīng)將生物素化的DNA捕捉探針固定在鏈霉親和素修飾的聚乙烯板上，然后滴加目標(biāo)DNA溶液，使其與捕捉探針雜交。第二步，取一定量鏈霉親和素修飾的5.91μm的磁球與過量的生物素化的檢測探針反應(yīng)，利用磁分離除

2、去過量的檢測探針。最后，將第一、第二兩步反應(yīng)的產(chǎn)物按一定比例混合，進(jìn)行第二次雜交反應(yīng)，通過目標(biāo)DNA與檢測探針的雜交，使形成捕捉探針—目標(biāo)—檢測探針—磁球的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而將磁球固定在聚乙烯板上。用倒置顯微鏡以×25倍或×40倍物鏡用CCD照像或×250或×400倍用眼觀察。如果在上面的第一步中，使固定在微孔板上的目標(biāo)DNA足夠稀，通過雜交反應(yīng)最終一個磁球上只結(jié)合一個目標(biāo)DNA分子，這樣，通過對磁球的計數(shù)檢測，就等于實現(xiàn)對單個DNA分子的計數(shù)

3、檢測。該方法的最大優(yōu)點是不需用復(fù)雜而昂貴的儀器，只用普通的顯微鏡配合常用的CCD(也可用目視)就可進(jìn)行單個目標(biāo)DNA分子的檢測。本章就雜交緩沖溶液的濃度、雜交方式、清洗次數(shù)和反應(yīng)時間進(jìn)行了討論，得到了最佳的雜交實驗條件。使用MctaMorph軟件對磁球進(jìn)行計數(shù)，實現(xiàn)了對目標(biāo)DNA單分子計數(shù)檢測，線性范圍5×10-16-1×10-14mol/L。 第二章建立了一種電化學(xué)檢測單個DNA分子的新方法。該方法基于核酸功能化的納米磁球?qū)崿F(xiàn)

4、DNA的初步放大，然后利用磁球表面的堿性磷酸酶的催化反應(yīng)實現(xiàn)第二次信號放大，最后利用毛細(xì)管作為單分子取樣通道并于柱端進(jìn)行電化學(xué)檢測。該方法具有以下幾個優(yōu)點： (1)靈敏度高。在本實驗中，不是通過檢測目標(biāo)DNA而是堿性磷酸酶催化底物得到的產(chǎn)物苯酚，苯酚通過磁球技術(shù)的DNA放大以及酶放大兩步放大反應(yīng)得到，使檢測信號大大增強(qiáng)。 (2)重現(xiàn)性好。在電化學(xué)檢測中電極表面的電化學(xué)活性的不穩(wěn)定常會導(dǎo)致電信號的重現(xiàn)性變差，而本方法不是根