產(chǎn)聚羥基丁酸(PHB)菌株的篩選鑒定及發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、聚羥基丁酸是一種生物可降解的高分子材料，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，其用途廣泛，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用價值。本文研究了從化工廠污水中篩選出1株能夠以甘油作為碳源來合成PHB的菌株。首先采用16S rDNA基因序列分析，確定該菌株屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）假單胞菌屬（Pseudomonas），然后依據(jù)與其相關(guān)的生理生化特性試驗，確定該菌為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），并將其命名為PP25

2、。進行初步發(fā)酵試驗，結(jié)果表明該菌以2％甘油作為主要碳源時，PHB產(chǎn)量為2.456g/L。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴建立紫外分光光度法及高效液相色譜法測定假單胞菌胞內(nèi)的PHB含量。在紫外分光光度法的建立中以超聲波破壁作為細胞破壁的預(yù)處理方法，考察了超聲時間、三氯甲烷的蒸發(fā)時間、水浴時間、硫酸用量等因素，確定最優(yōu)試驗條件。紫外分光光度法于1.0~3.5μg/mL內(nèi)呈線性關(guān)系。采用該方法對樣品測定時的回收率是95.93%~104.79

3、%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是1.13%~4.27%。高效液相色譜法采用Aminex HPX-87C分析柱，采用紫外檢測器對胞內(nèi)的PHB進行分離測定。經(jīng)過色譜條件優(yōu)化，最終確定5 mmol/L硫酸作為流動相，流速選擇0.7 mL/min，柱溫選擇50℃。采用高效液相色譜法檢測樣品時回收率是98.91%~101.97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.763%~2.014%。⑵研究了溫度、搖床轉(zhuǎn)速、初始 pH、接種量、裝液量、碳源、氮源、無機鹽、金屬離子等因素對P

4、P25生長及PHB積累的影響。然后依據(jù)Placket-Burman試驗，篩選對PP25菌株合成PHB有顯著影響的因素。結(jié)果表明：甘油，硫酸銨及初始pH3個因子對PP25菌株合成PHB有顯著的影響。利用最陡爬坡試驗及響應(yīng)面分析法探究3個顯著因素對PP25菌株積累PHB的關(guān)系。結(jié)果表明：當(dāng)甘油為26.892 g/L，(NH4)2SO4為3.043 g/L，初始pH為7.004時，聚羥基丁酸最大估計值為8.062 g/L。經(jīng)過對模型驗證， P

5、HB實際合成為7.881 g/L，與理論產(chǎn)量相似，比優(yōu)化前提高了32.52%。最終確定最優(yōu)的條件為是甘油26.892 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO43.043 g/L，Na2HPO4·12H2O15 g/L， NaH2PO2·H2O4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.4 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，初始pH7.004。⑶探究了通氣量、溫度、pH對PP25菌株在5 L發(fā)酵罐中積累PHB的影響。結(jié)果表明：通氣量

6、選擇1.2 vvm、溫度選擇28℃和pH選擇6.5時，菌體生物量為18.04 g/L， PHB產(chǎn)量為10.617 g/L。比優(yōu)化前分別提高了46.19%和78.95%。在此基礎(chǔ)上，進行不同時間段補加甘油及補加不同C/N比的復(fù)合碳氮源補料工藝研究，確定在發(fā)酵24 h后補加C/N比為5:1的復(fù)合碳氮源（甘油60 g，硫酸銨12 g）時，比只補加甘油時分別提高了19.42%和19.11%。⑷研究了珠磨時間、珠磨質(zhì)量、氯仿提取時間、溫