蛋白質(zhì)的磁性微球快速酶解與高效富集新方法研究.pdf

1、本論文針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨的快速酶解以及磷酸化蛋白高效選擇性富集方面的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，將功能化磁性微球與蛋白質(zhì)分析結(jié)合起來，開展了一系列研究工作，發(fā)展了相關(guān)的新技術(shù)新方法并進(jìn)行了實(shí)際的應(yīng)用研究，取得了一些創(chuàng)新性研究結(jié)果。主要研究?jī)?nèi)容和取得的主要研究成果摘要如下：
　　 第一章概述了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的現(xiàn)狀，基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)以及新興的翻譯后修飾蛋白組學(xué)的重要意義；就目前固定化酶反應(yīng)器及其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用，以及

2、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的富集技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述；概述了功能化磁性微球及其在生物分析中的應(yīng)用；最后提出了本論文選題的目的和意義。
　　 第二章分別運(yùn)用金屬離子螯合和共價(jià)鍵合兩條技術(shù)路線，合成了表面固定酶的磁性硅球材料并將其應(yīng)用于毛細(xì)管/微流控芯片酶解反應(yīng)器。首先，采用水熱法制備了具有超順磁性的四氧化三鐵磁性微球；然后采用溶膠-凝膠法在其表面包覆二氧化硅層，合成了具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@SiO2磁性硅球。在此基礎(chǔ)上，發(fā)展了兩條

3、不同的固定酶的方法，即金屬離子螯合法和共價(jià)鍵合法，將胰蛋白酶固定在磁性硅球表面。
　　 利用外加磁場(chǎng)的作用，在不需要制作塞子的情況下，將用兩種不同方法合成的固定酶的磁性硅球分別填充到毛細(xì)管或者微流控芯片通道內(nèi)部。蛋白質(zhì)溶液在泵的推動(dòng)下，流過毛細(xì)管或者微流控芯片通道，從而得到快速的酶解。使用MALDI質(zhì)譜對(duì)收集到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明，用兩種不同的固定酶方法制得的毛細(xì)管/微流控芯片酶反應(yīng)器均能在5分鐘的酶解時(shí)間內(nèi)達(dá)到與1

4、2小時(shí)傳統(tǒng)溶液酶解相同或更好的酶解效果。該方法易于操作、成本低；由于材料的磁性，毛細(xì)管/芯片通道內(nèi)的磁性微球還可以進(jìn)行方便快速地替換，很好地解決了以前文獻(xiàn)報(bào)道中毛細(xì)管/芯片酶反應(yīng)器只能一次性使用的缺點(diǎn)。對(duì)用金屬離子螯合方法固定酶的磁性微球而言，還可以用EDTA將磁性微球表面的銅離子除去，再重新引入新的銅離子和蛋白酶，從而實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管/微流控芯片酶反應(yīng)器的再生。
　　 第三章發(fā)展了更為簡(jiǎn)便的方法，運(yùn)用一步水熱法合成了氨基四氧化三鐵磁

5、性微球，從而將固定酶的磁性微球的合成步驟由第二章中的6步簡(jiǎn)化到3步，大大縮短了合成的時(shí)間。
　　 在上述工作的基礎(chǔ)上，將固定酶的磁性微球進(jìn)一步應(yīng)用于蛋白質(zhì)的靶上酶解。將磁性微球分散液滴加到已經(jīng)預(yù)先滴加好蛋白溶液的靶板上，酶解一段時(shí)間后，用磁化的鋼針把固定酶的磁性微球從靶板上分離出來，從而終止酶解過程。這樣，我們既利用了固定化酶技術(shù)提高了酶解效率，又避免了對(duì)質(zhì)譜離子源光柵的污染。最后，為了證實(shí)本方法在復(fù)雜生物樣品檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用性

6、，我們對(duì)大鼠肝臟提取蛋白的液相色譜流分就行了酶解鑒定。
　　 第四章針對(duì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組研究中亟待解決的磷酸化蛋白及肽段的分離富集問題，用固定金屬親和色譜(IMAC)原理，在Fe3O4@SiO2磁性硅球表面鍵合上可以螯合金屬離子的官能基團(tuán)，再將對(duì)磷酸化蛋白/肽段有特異性吸附作用的鈰離子固定在磁球表面。由于材料的磁性，當(dāng)磷酸化肽段富集到磁性微球上以后，只需將磁鐵放置在盛放溶液的離心管外壁，就可以輕松實(shí)現(xiàn)富集了磷酸化肽段的磁性微球

7、與非磷酸化肽段溶液的分離。文獻(xiàn)調(diào)研顯示，F(xiàn)e3+和Ga3+是IMAC富集中最常使用的金屬離子，而目前尚未有將Ce4+成功地應(yīng)用于磷酸化肽富集的文獻(xiàn)見諸報(bào)道。因此，在本論文中，我們還進(jìn)一步比較了螯合Ce4+的磁性微球與螯合Fe3+的磁性微球?qū)α姿峄亩蔚母患省＝Y(jié)果表明，螯合Ce4+的磁性微球?qū)?fù)雜混合物中磷酸化肽段的選擇性富集效果優(yōu)于螯合Fe3+的磁性微球。即使在酶解肽段溶液中BSA的量是β-casein的量的50倍的情況下，螯合Ce

8、4+的磁性微球仍可在30 s內(nèi)將β-casein中的痕量磷酸化肽段有效地富集出來。在此基礎(chǔ)上，我們還首次成功地將螯合Ce4+的磁性微球用于選擇性富集人血清中(不需要其它的預(yù)處理步驟)的磷酸化肽段，為磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究開辟了新的道路。
　　 第五章創(chuàng)新性地探索了在四氧化三鐵磁性微球表面均勻包覆過渡金屬氧化物的新方法。采用磁球外部包覆碳層為模板包覆過渡金屬氧化物、隨后灼燒去除碳層的方法，制備了結(jié)構(gòu)緊密的具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@

9、MxOy超順磁性微球。該磁性微球具有與IMAC材料不同的富集機(jī)理，具有更高的化學(xué)惰性和穩(wěn)定性。利用該方法將不同的過渡金屬氧化物，如Al2O3，ZrO2，Ga2O3等分別包覆到四氧化三鐵磁性微球表面。采用振動(dòng)樣品磁場(chǎng)計(jì)、傅立葉變換紅外光譜儀、透射及掃描電子顯微鏡等對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征與確認(rèn)。我們進(jìn)而優(yōu)化了這些材料富集磷酸化肽段的實(shí)驗(yàn)條件，包括富集體系、富集時(shí)間、樣品洗脫時(shí)間等，驗(yàn)證了表面包覆不同金屬氧化物的Fe3O4@MxOy磁性微球?qū)τ趶?fù)雜

10、體系中的磷酸化肽段均有很好的選擇性富集效果，并進(jìn)一步將其應(yīng)用于人血清及脫脂牛奶、鼠肝蛋白酶解產(chǎn)物中磷酸化肽的富集鑒定。
　　 總之，本論文針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨的快速酶解與高效富集方面的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，以功能化磁性微球?yàn)榛A(chǔ)，以發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究新技術(shù)新方法并進(jìn)行實(shí)際的應(yīng)用研究為目標(biāo)，合成了多種表面帶有不同功能基團(tuán)的磁性微球并建立了相應(yīng)的分析方法，為解決蛋白質(zhì)快速酶解、磷酸化肽段高效分離富集及鑒定等問題提供了新穎有效的研究