水楊醛席夫堿金屬配合物的合成、表征及PTP1B抑制活性研究.pdf

1、屬于重大疾病之一的糖尿病，對人類危害十分嚴重，迄今為止還沒有徹底治療的有效方法。糖尿病發(fā)病的關鍵因素是胰島素分泌不足和胰島素抵抗，眾多研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)對胰島素信號傳導具有負性調節(jié)作用，PTP1B的表達水平在糖尿病或發(fā)生胰島素抵抗時明顯增高，而且PTP1B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有密切關系。因此開展對蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制劑的研究，并探索抑制劑與酶作用機理，不僅對于研究生物體中的信號傳導具有重要的理論價值，也有利于

2、開發(fā)新型抗糖尿病及抗癌藥物。
　　目前國內外關于PTP1B抑制劑的報道很多，其中以有機小分子居多，但是無機小分子抑制劑的研究卻非常少。大量研究表明微量金屬元素如V、Cr、Cu、 Zn等特別是V與糖尿病的預防和治療密切相關，但其作用機制仍不明確。一些研究表明釩配合物可能通過抑制PTP活性發(fā)揮降血糖作用。為了進一步深入探討釩配合物的降血糖活性和機理，我們選擇了一些具有廣泛生物活性的配體，設計合成了各種新的金屬配合物，研究了這些配合物對

3、PTP1B活性的抑制作用，并進行了初步的選擇性和作用機理研究。本論文的主要研究成果如下:
　　1.合成了一系列新型的水楊醛及其衍生物縮鄰氨基苯甲酸-多吡啶-氧釩三元配合物，運用元素分析、晶體衍射、紅外光譜、電子順磁共振光譜、密度泛函理論計算、摩爾電導、紫外光譜、電噴霧質譜、電位滴定等手段對其結構進行了表征，結果表明，這是一類穩(wěn)定的具有六配位變形八面體結構的中性氧釩(Ⅳ)配合物。在配合物結構特性研究的基礎上，首次研究了這類三元氧釩配

4、合物對PTP1B活性的抑制作用及模式，初步探討了配合物與PTP1B作用的機理。配合物對PTP1B的半數(shù)抑制濃度(IC50)只有幾十納摩爾，而且相對于SHP-1和TCPTP來說，這類配合物對PTP1B有適度的選擇性。另外，穩(wěn)態(tài)動力學實驗也表明這類配合物以競爭模式與PTP1B相互作用，所以該類配合物是高效的、適度選擇性的、典型的競爭型PTP1B抑制劑。結合配合物競爭型的作用模式，利用分子模擬的方法初步探索了該類配合物與PTP1B活性位點相互

5、作用的可能模式，即配合物憑借其比較適合的結構進入PTP1B酶的催化域口袋并且主要通過其釩氧及鄰近基團與PTP1B活性位點作用。
　　文獻報道苯環(huán)上引入不同取代基時，由于電子效應、空間效應的影響，這些取代基會對其合成的化合物生物活性有一定的影響，為了比較取代基對抑制活性的影響，我們進一步在水楊醛的苯環(huán)上引入溴或者將苯環(huán)用萘環(huán)取代，然后與鄰氨基苯甲酸縮合而成兩種新的席夫堿，5-溴水楊醛縮鄰氨基苯甲酸席夫堿和2-羥基-1-萘醛縮鄰氨基苯

6、甲酸席夫堿，利用這兩種席夫堿和多吡啶配體合成一系列類似的新型氧釩配合物，研究了配合物與PTP1B的相互作用，結果表明，該類配合物的抑制活性要略低于沒有取代基的相應配合物，這可能是由于取代基的引入對配合物進入酶的催化域口袋產生一些位阻作用，但是在這個空間結構中位阻還沒有足夠大到阻止配合物進入酶的催化域口袋，所以與沒有取代基的配合物抑制活性相比，該類配合物對PTP1B活性的抑制作用變化不明顯。
　　2.動物實驗已經表明，配位形式為VO

7、(N2O2)的配合物有非常顯著的抗糖作用，所以我們選擇含有N2O2配位基的水楊醛雙席夫堿作為配體，合成一系列新的水楊醛及其衍生物縮芳胺雙席夫堿氧釩配合物，利用元素分析、紅外光譜、摩爾電導、紫外光譜、電子順磁共振光譜和密度泛函理論計算等手段對其結構進行了表征，并用紫外光譜測定了配合物在緩沖溶液中的穩(wěn)定性動力學。結果表明這是一類穩(wěn)定的具有五配位扭曲四方錐結構的中性氧釩(Ⅳ)配合物。同樣，我們也首次研究了該類配合物與PTP1B的相互作用，發(fā)現(xiàn)

8、所合成的這些配合物對PTP1B都具有很好的抑制活性，半數(shù)抑制濃度IC50值在15～133nM范圍內，從IC50值結果可以看出，配合物中不同部位取代基的改變對配合物的PTP1B抑制作用有不同的影響結果。其中席夫堿配體中水楊醛上取代基的引入主要是對配合物進入PTP1B活性區(qū)域時產生一定的空間位阻，而且取代基越大，位阻也就越大，而席夫堿配體中鄰苯二胺上取代基的引入可能主要是通過電子的推拉效應影響氧釩離子與PTP1B活性部位的相互作用，結果還表

9、明吸電子基的引入能夠提高配合物的抑制活性。另外，以水楊醛縮鄰苯二胺雙席夫堿氧釩配合物為例，酶動力學實驗研究表明，該類配合物是典型的競爭型抑制劑。根據實驗結果并結合分子模擬計算，推測配合物也是以釩氧端與PTP1B活性部位結合的。
　　3.銅和鋅是重要的生命金屬元素，以DNA為作用靶點的銅配合物抗腫瘤活性的研究已有很多報道，但是以PTP1B為作用靶點的銅配合物的各種生物活性研究還沒見文獻報道，我們課題組以PTP1B為作用靶點，首次探索

10、了銅配合物以及席夫堿鋅配合物對PTP1B活性的抑制作用。本文中，合成了分別以水楊醛縮芳胺席夫堿和1,10-鄰菲噦啉為配體的銅、鋅配合物，運用元素分析、晶體衍射、紅外光譜、摩爾電導、紫外光譜等手段對其結構進行了表征，并研究了這些配合物對PTP1B的抑制作用。實驗結果表明，這些配合物都能很好的抑制PTP1B酶的活性，它們的IC50值在10-6～10-7M數(shù)量級范圍。進一步的研究表明，還原型谷胱甘肽的存在一定程度上降低了席夫堿銅配合物對PTP

11、1B抑制的作用，氧氣的存在增強鄰菲噦啉銅配合物對PTP1B的抑制，我們推測銅配合物抑制PTP1B酶活性的過程可能存在氧化機理。我們初步認為這個機理可能不同于產生羥基自由基的氧化機理，因為還原劑GSH的去除對銅配合物的抑制活性沒有明顯的影響，更進一步的機理研究還在繼續(xù)中。另外，值得一提的是雙核銅配合物[Cu(phen)2(μ-IDA)Cu(phen)(NO3)]NO3·4H2O是以一種很少見的反競爭方式來抑制PTP1B活性的，而且比較配合

12、物對PTP1B、TCPTP和SHP-1活性的抑制能力可以發(fā)現(xiàn)，該配合物對TCPTP活性的抑制有一定的選擇性。
　　4.嘗試用浸泡法觀察在金屬配合物中浸泡24小時后PTP1B的蛋白晶體的變化，比較浸泡前后PTP1B晶體的初步結構發(fā)現(xiàn)，金屬抑制劑作用之前PTP1B活性區(qū)域口袋形狀比較明顯，活性位點Cys215上的巰基向上伸展，當金屬抑制劑作用之后PTP1B活性區(qū)域口袋形狀就變得有些不太清楚了，活性位點Cys215上的巰基也都向袋子口方

13、向伸展，這可能是由于金屬抑制抑制劑與活性位點發(fā)生作用的原因。特別值得一提的是，從經過銅配合物溶液浸泡后的PTP1B晶體結構中我們發(fā)現(xiàn)活性位點Cys215上的巰基有部分被氧化和成環(huán)的趨勢，這一現(xiàn)象與prof.H.Jhoti等2003年在Nature上報道的雙氧水氧化PTP1B的機理有點類似，為我們今后更深入地研究PTP1B銅配合物抑制劑奠定了堅實的理論基礎。
　　本論文創(chuàng)新之處:獲得一系列新型的金屬配合物，首次研究了這些配合物對PT