基于DNA酶和小分子連接DNA末端保護(hù)的蛋白質(zhì)熒光分析.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命體的基本組成成分，是維持生命正常生理功能的重要活性物質(zhì)。蛋白質(zhì)與營養(yǎng)代謝、物質(zhì)運(yùn)輸、機(jī)能防御、遺傳等生理活動(dòng)密切相關(guān)。而且有研究表明，在疾病的發(fā)展過程中，一些特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)與分布也會(huì)發(fā)生改變，因此蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)對(duì)掌握蛋白質(zhì)的生理功能，研究蛋白質(zhì)參與的生理活動(dòng)以及相關(guān)疾病的診斷、治療都具有重要意義。基于小分子配體和蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用的末端保護(hù)原理最近引起了蛋白質(zhì)研究工作者的廣泛興趣。末端保護(hù)是指首先將小分子配體連

2、接在DNA上，目標(biāo)蛋白質(zhì)與小分子配體結(jié)合后，能夠阻止外切酶對(duì)連接小分子的DNA鏈進(jìn)行消解。末端保護(hù)對(duì)DNA序列的編碼無限制，可以與各種基于核酸的擴(kuò)增技術(shù)和檢測(cè)手段相結(jié)合，這為蛋白質(zhì)分子的靈敏檢測(cè)提供了新的途徑。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴設(shè)計(jì)了一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA探針。探針3'端標(biāo)記有生物素（biotin）。當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)-鏈霉親合素（STV）不存在時(shí)，核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）能夠特異性地從3'端水解 DNA探針的雙鏈部分。未被水解

3、的探針的單鏈部分能夠形成DNA酶（DNAzyme）結(jié)構(gòu)。DNAzyme與加入的分子信標(biāo)結(jié)合，在中間的RNA堿基處將分子信標(biāo)切斷。分子信標(biāo)上的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)因此而分離，熒光信號(hào)恢復(fù)。之后， DNAzyme又與新的分子信標(biāo)結(jié)合，發(fā)生剪切作用，釋放熒光基團(tuán)。DNAzyme不斷循環(huán)利用，直至全部的分子信標(biāo)參與反應(yīng)，熒光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)。加入目標(biāo)蛋白質(zhì) STV后， STV與biotin特異性結(jié)合，能夠阻止ExoⅢ從3'端水解DNA探針的雙鏈部分。

4、DNA探針仍然保持發(fā)夾結(jié)構(gòu)，無法形成 DNAzyme。沒有 DNAzyme的作用，分子信標(biāo)不能被切斷，保持熒光猝滅狀態(tài)。該方法通過熒光信號(hào)的降低對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定，可以檢測(cè)到低至50 pmol的STV。方法簡單快速，檢測(cè)成本低，但靈敏度還有待于進(jìn)一步提高。⑵將與小分子連接的DNA探針設(shè)計(jì)成DNAzyme的序列。目標(biāo)蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合后，末端受到蛋白質(zhì)保護(hù)，核酸外切酶Ⅰ（ExoⅠ）不能消解DNA探針。DNA探針保持DNAzyme結(jié)構(gòu)

5、，與加入的分子信標(biāo)結(jié)合，切斷分子信標(biāo)，釋放熒光信號(hào)。DNAzyme不斷循環(huán)利用，與新的分子信標(biāo)結(jié)合，發(fā)生剪切反應(yīng)，釋放出越來越多的熒光基團(tuán)，產(chǎn)生越來越強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)沒有目標(biāo)蛋白質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，DNA探針被ExoⅠ水解，DNAzyme結(jié)構(gòu)消失，加入的分子信標(biāo)保持淬滅狀態(tài)，體系熒光信號(hào)很弱。通過檢測(cè)熒光信號(hào)的增長來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。我們將該方法分別應(yīng)用于鏈霉親和素（STV）和葉酸受體（FR）的檢測(cè)，取得了良好的效果。該方法可以檢測(cè)到低至