Bt蛋白仿生親和聚合物納米顆粒的研制及性能評價.pdf

1、Bt蛋白是由蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）在芽孢形成過程中產(chǎn)生的一種對鱗翅目、雙翅目和鞘翅目幼蟲具有高毒力和高特異性殺蟲活性的蛋白質(zhì)伴胞晶體，又稱δ-內(nèi)毒素或殺蟲晶體蛋白。由于其具有殺蟲活性頻譜廣、專一性強(qiáng)，對人類和高等動物幾乎無毒無害的優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于Bt殺蟲劑和轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲作物中。Bt蛋白可以通過轉(zhuǎn)基因作物的植株殘?bào)w、根及根系分泌物和花粉飄落等途徑進(jìn)入土壤和水體生態(tài)系統(tǒng)，其在環(huán)境中的殘留、富集所

2、引發(fā)的環(huán)境和生態(tài)風(fēng)險問題已經(jīng)得到廣泛的關(guān)注，而現(xiàn)有的檢測方法存在很多弊端。因此，如何實(shí)現(xiàn)對環(huán)境中Bt蛋白的特異性識別、提取、分離和純化將具有重要意義。
　　仿生親和吸附劑材料在蛋白質(zhì)的提取、分離和純化方面應(yīng)用較廣。依據(jù)自然界中生物大分子之間互補(bǔ)的多重相互作用原理，利用常見的疏水性、親水性和帶電性功能單體，通過調(diào)節(jié)功能單體的種類和配比來合成對目標(biāo)多肽、蛋白質(zhì)、多糖等具有不同親和性的聚合物納米顆粒，是目前研究非常熱門的一種仿生親和配體

3、制備方法。氨基酸作為多肽和蛋白質(zhì)的組成單位，如果能被引入到聚合物側(cè)鏈中，則可通過非共價鍵如氫鍵作用力增加形成二級結(jié)構(gòu)以及更高度有序結(jié)構(gòu)的可能性，從而使得聚合物的結(jié)構(gòu)更接近生物大分子。由于氨基酸型聚合物具有生物相容性好、易生物降解、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，使其在仿生材料、醫(yī)用材料等方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。因此，N-丙烯?；?氨基酸可以作為一種理想的功能單體用于仿生親和聚合物納米顆粒的合成。
　　本文以氨基酸為原料合成了幾種疏水性不同的N

4、-丙烯?；?氨基酸功能單體，通過調(diào)節(jié)氨基酸單體與其它親水性和疏水性單體的配比合成了一系列具有不同親和性的聚合物納米顆粒，從合成的聚合物納米顆粒文庫中篩選出一種對Bt Cry1Ab蛋白具有最高親和力的聚合物納米顆粒，對其吸附Bt Cry1Ab蛋白的條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，對Bt Cry1Ab蛋白在聚合物納米顆粒表面的等溫吸附、動力學(xué)吸附、選擇性、吸附-解吸等性能進(jìn)行綜合評價。具體工作包括以下四個部分:
　　1.利用氨基酸與丙烯酰氯發(fā)生?；?/p>

5、反應(yīng)，合成了四種N-丙烯?；?L-氨基酸單體包括N-丙烯?；?L-甘氨酸(AGly)，N-丙烯?；?L-丙氨酸(AAla)，N-丙烯?；?L-纈氨酸（AVal），N-丙烯?；?L-苯丙氨酸(APhe)，采用1H NMR、FT-IR方法對合成的N-丙烯酰基-L-氨基酸單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征;通過調(diào)節(jié)這四種N-丙烯?；?L-氨基酸單體與N-叔丁基丙烯酰胺和N-異丙基丙烯酰胺的配比，采用沉淀聚合法制備出一系列具有氨基酸側(cè)鏈的聚合物納米顆粒AGly-

6、NPs，AAla-NPs，AVal-NPs，APhe-NPs，并對其濃度、產(chǎn)率、粒徑、Zeta電位等進(jìn)行了表征。
　　2.在pH6.88，10mM的PBS緩沖溶液中對所合成的聚合物納米顆粒文庫進(jìn)行初步篩選實(shí)驗(yàn)，篩選出對Bt Cry1 Ab蛋白具有最高親和力的聚合物納米顆粒為APhe-NP2(APhe50％，NIPAm48％);通過對吸附條件如pH、緩沖液濃度和鹽濃度的優(yōu)化，得到最佳吸附條件為:pH6.010 mM PBS緩沖液。<

7、br>　　3.吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明APhe-NP2對Bt Cry1Ab蛋白的吸附速率非?？?，8 min即可達(dá)到吸附平衡;等溫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APhe-NP2對Bt Cry1Ab蛋白的最大吸附量可達(dá)330.8 mg/g。SDS-PAGE結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液pH為6.0時，APhe-NP2能夠高效吸附Bt Cry1Ab蛋白，而當(dāng)pH8.0或10.0時，吸附在APhe-NP2上的Bt Cry1Ab蛋白幾乎能夠完全解吸下來，表明該聚合物納米顆粒具有

8、吸附和釋放Bt Cry1Ab蛋白的pH響應(yīng)特性。
　　4.比較了APhe-NP2對Bt Cry1Ab蛋白的同源蛋白，如Bt Cry1Ac蛋白，非同源蛋白，如Bt Cry1F蛋白，以及其它常規(guī)蛋白，包括分子量相似、等電點(diǎn)較接近的牛血清白蛋白和人血清白蛋白，分子量及等電點(diǎn)都有很大差異的胃蛋白酶和卵清蛋白的吸附能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)APhe-NP2對Bt Cry1Ab蛋白及其同源蛋白Bt Cry1Ac具有非常高的吸附容量，而對其它幾種蛋白的吸附