奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆、表達(dá)與溶血活性分析.pdf

1、根據(jù)GenBank上發(fā)表的金黃色葡萄球菌RF122β-溶血素(h/b)基因序列，用OLIGO6.0設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，對(duì)金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的hlb基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片斷含有993bp的ORF，可編碼含330個(gè)氨基酸的成熟蛋白，與已報(bào)道的金黃色葡萄球菌RF122β-溶血素蛋白的氨基酸組成同源性為99.4％。軟件分析顯示我們克隆的金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的β-溶血素氨基酸序列中

2、含有核酸內(nèi)切酶/核酸外切酶/磷酸酶(Endonuclease/Exonuclease/phosphatasefamily)和金屬依賴性水解酶ELSH(Metal-dependenthydrolase)兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，說明我們克隆的金黃色葡萄球菌β-溶血素是一種依賴于金屬離子的磷脂酶；進(jìn)化樹分析可見牛源金黃色葡萄球菌山東分離株zfb的β-溶血素與其它β-溶血素/磷脂酶既有高度的同源性，又存在一定的差異。 通過對(duì)pMD18-T/hl

3、b及pET32a+進(jìn)行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切、連接，將hlb基因定向插入pET32a+，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a/hlb，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以融合表達(dá)的包涵體形式存在，SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)水平，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白分子量為57KD，表達(dá)量占菌體總蛋白的23.9％。 表達(dá)產(chǎn)物利用重組表達(dá)蛋白所帶的6×His

4、標(biāo)簽用鎳柱親和層析方法對(duì)其進(jìn)行純化，并用96孔血凝板測(cè)定重組蛋白的溶血效價(jià)，結(jié)果顯示金葡菌β-溶血素對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血效價(jià)為278HU/mg，對(duì)奶牛紅細(xì)胞的溶血效價(jià)為9×103HU/mg；以血瓊脂平板法檢測(cè)重組蛋白與無乳鏈球菌的CAMP反應(yīng)，結(jié)果顯示重組蛋白在血瓊脂平板上和無乳鏈球菌能發(fā)生明顯的CAMP反應(yīng)。 上述結(jié)果表明，我們成功克隆并表達(dá)了牛乳中金黃色葡萄球菌β-溶血素，純化后的重組蛋白保存了很好的溶血活性，而且該毒素對(duì)奶牛