仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料調(diào)控單核細胞促骨原位再生的研究.pdf

1、近年來，用于骨缺損修復的人工替代材料的研究取得了很大的進展，大量新型的修復材料已在臨床上取得了廣泛的應用。然而不同的材料由于其理化性能、機械性能以及生物應用性能方面的不同，修復效果差異很大。生物材料在植入體內(nèi)后，宿主的免疫應答反應是影響其最終應用效果的最重要的因素之一。在早期的研究中，組織修復的研究策略傾向于抑制宿主的免疫應答來提高移植的成功率。而目前普遍接受的觀點認為，宿主的免疫應答能夠?qū)M織再生修復起到積極的免疫調(diào)控作用，從而促進缺

2、損修復以及組織再生。單核細胞是宿主免疫應答調(diào)控中的重要細胞，同時也是骨改建以及骨缺損修復進程中不可或缺的關(guān)鍵細胞之一，單核細胞與植入體內(nèi)的生物材料之間的相互作用也是影響生物材料移植成功的關(guān)鍵因素之一。仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架（SCS），以膠原纖維內(nèi)部無定形水合二氧化硅有序沉積為特征，是一種具有良好理化性能和機械性能的生物材料。在前期的研究中，這種支架材料，在體外實驗中表現(xiàn)出了良好的促進骨再生修復的潛力。然而其在體內(nèi)應用于骨缺損的修復效果尚

3、不明確，同時宿主免疫系統(tǒng)對其產(chǎn)生的反應目前仍未得到相關(guān)的評估。在本研究中，我們對仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料在骨缺損修復中的應用進行了全面的生物學評估，驗證了其在動物模型上修復骨缺損的效果，并對其與宿主的免疫調(diào)控之間的相互作用進行了相關(guān)的探索，驗證了該支架材料與單核細胞之間的作用，以及通過調(diào)控單核細胞來促進組織血管化、種子細胞募集，以及促進骨再生的作用。
　　1.研究思路
　　在第一部分實驗中，我們采用膠原纖維模板誘導納米液相

4、礦物質(zhì)前體（無定形硅酸）纖維內(nèi)定向沉積的技術(shù)，構(gòu)建出了仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架，并使用顯微CT（Micro-CT）技術(shù)和透射電子顯微鏡（TEM）技術(shù)對所構(gòu)建出的纖維內(nèi)硅化膠原支架進行了形貌觀察；隨后對其在體液環(huán)境中的硅酸的緩釋水平進行了測定。通過小鼠體內(nèi)異位植入模型對仿生纖維內(nèi)硅化膠原材料的生物相容性進行了全面的評價：通過淋巴細胞二次刺激增殖實驗評價硅化膠原的免疫原性；采用流式細胞技術(shù)（Flow Cytometry）評價異位植入的材料對循

5、環(huán)淋巴細胞水平以及活性的影響；通過ELISA實驗觀察異位植入的材料對循環(huán)炎癥因子水平的影響；通過植入部位組織學切片的HE染色來觀察原位炎癥細胞的浸潤情況，為其進一步用于骨缺損修復提供了實驗基礎。
　　在第二部分實驗中，我們應用纖維內(nèi)硅化膠原支架修復了小鼠的顱骨缺損，并對其修復效果進行了評估。在植入后即刻、1個月、3個月時采用Micro-CT技術(shù)對骨缺損的修復情況、新骨形成量以及骨密度進行了測定；采用貫序熒光標記技術(shù)對修復后3個月時

6、的骨改建活性進行了評估；使用修復后3個月時的組織標本制作硬組織切片，采用Van Gieson染色（VG staining）和von Kossa銀染（VK sliver staining）技術(shù)對切片分別進行染色，在組織學水平觀察原位骨再生的情況；在修復后3個月時，采用血管造影技術(shù)對缺損原位的血管再生水平進行評估；在修復后1個月時進行組織學切片，通過免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence）、免疫組織化學技術(shù)（Immunohist

7、ochemistry）對缺損部位相關(guān)的單核巨噬細胞，以及骨修復過程中的相關(guān)細胞因子表達水平進行評估，并采用 TRAP染色（tartrate-resistant acid phosphatase staining）對骨改建活性進行評估。
　　在第三部分實驗中，我們通過體外實驗進一步對纖維內(nèi)硅化膠原支架材料對單核細胞的調(diào)控作用進行了深入研究。通過細胞增殖實驗、凋亡實驗、細胞內(nèi)活性氧水平測定實驗來檢測支架材料對單核細胞增殖、凋亡、活性氧

8、水平的影響；采用TRAP細胞染色技術(shù)來檢測支架材料對單核細胞分化的影響；通過細胞免疫熒光染色技術(shù)、qRT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測支架材料對單核細胞相關(guān)細胞因子分泌水平的影響；通過Transwell細胞遷移實驗檢測支架材料與單核細胞相互作用后對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）和血管內(nèi)皮前體細胞（EPCs）遷移的影響；通過Matrigel血管形成實驗檢測對EPCs成血管能力的影響；通過添加中和抗體來檢驗支架材料調(diào)控單核細

9、胞影響細胞遷移與血管生成的關(guān)鍵細胞因子。
　　在第四部分實驗中，我們采用仿生硅化膠原支架材料修復SD大鼠的股骨缺損，進一步對支架材料通過影響單核細胞調(diào)控骨再生的信號通路進行了研究。通過顯微CT技術(shù)、免疫組織化學技術(shù)以及Van Geison染色技術(shù)對支架材料修復后1個月時，缺損部位的成骨水平，以及血管生成水平進行了評估；采用免疫熒光雙標技術(shù)對缺損原位的單核細胞以及相關(guān)細胞因子的表達水平進行評估；并進一步在體外實驗中，采用Wester

10、n Blot技術(shù)對單核細胞相關(guān)的分子信號通路進行了檢測；采用Western Blot技術(shù)、TRAP細胞染色技術(shù)以及Transwell細胞遷移實驗、Matrigel血管形成實驗驗證相關(guān)信號通路對單核細胞分化和分泌的影響；最后通過體內(nèi)應用通路抑制劑，來觀察相關(guān)信號通路阻斷后，股骨缺損修復水平的改變。
　　2.實驗結(jié)果
　　第一部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架的制備與表征
　　1)透射電鏡觀察下，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料的纖維

11、內(nèi)部間隙中可見無定形的二氧化硅有序沉積，從而形成明顯的帶狀結(jié)構(gòu)。Micro-CT結(jié)果可見仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架為具有多孔隙特征的三維網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)。在模擬體液環(huán)境中，材料能夠穩(wěn)定的緩釋硅酸，在1-10天時緩釋速度較快，10-30天時緩釋速度趨于平穩(wěn)，平均每100mg硅化膠原在10mL PBS中暴露30天后，溶液中的硅酸濃度能達到約1.2mmol/L的水平。
　　2)仿生硅化膠原支架材料的生物相容性評價結(jié)果顯示：材料具有較低的免疫

12、原性，對淋巴細胞的二次刺激并沒有引起明顯的增殖反應（p＞0.05）；同時，材料的異位植入對循環(huán)淋巴細胞的數(shù)量、活性沒有影響（p＞0.05），循環(huán)中的炎癥因子濃度也維持在正常水平（p＞0.05）；原位組織學切片的 HE染色結(jié)果顯示，硅化膠原支架在植入后7天、14天發(fā)生了明顯的吸收，材料周圍無明顯炎癥細胞浸潤，證明了仿生硅化膠原支架材料具有良好的生物相容性，可以進一步安全地應用于體內(nèi)骨缺損修復。
　　第二部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架修

13、復小鼠顱骨缺損的體內(nèi)實驗研究
　　1)Micro-CT結(jié)果顯示仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠明顯的提升小鼠顱骨缺損的修復水平（P＜0.05）。和對照組相比，在術(shù)后三個月時，能夠觀察到形成了更多的新骨，同時其修復后的骨組織的改建活動更加活躍。
　　2)與對照組相比，在術(shù)后三個月硅化膠原支架材料修復后的顱骨缺損區(qū)域形成了更多的血管組織，其血管長度、厚度、連接性均明顯高于對照組（P＜0.05）。
　　3)在術(shù)后一個月時，硅化

14、膠原支架材料修復的缺損區(qū)域出現(xiàn)了更多的CD31+Endomucin+雙陽性的血管，并且有更多的PDGF-BB表達；缺損區(qū)域內(nèi)TRAP陽性的單核細胞數(shù)量明顯增多，同時單核細胞表達更多的趨化因子SDF-1以及轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1；在硅化膠原支架材料修復后，缺損區(qū)域有更多的骨髓間充質(zhì)干細胞標志物Nestin以及血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達，提示募集到了更多的修復種子細胞（p均＜0.05）。
　　第三部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架調(diào)控

15、單核細胞影響成骨成血管的實驗研究
　　1)硅化膠原支架材料對單核細胞的增殖、凋亡和細胞內(nèi)活性氧水平均沒有影響（p＞0.05）；材料自身所緩釋的浸提液對BMSCs和EPCs的遷移也沒有影響（p＞0.05）。
　　2)硅化膠原支架材料能夠促進單核細胞向 TRAP陽性的單核細胞分化（P＜0.05），該類型的單核細胞能夠在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達更多的相關(guān)細胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）（p均＜0.05）。

16、
　　3)使用硅化膠原支架材料對單核細胞進行刺激后的條件培養(yǎng)基能夠明顯的促進BMSCs和EPCs的遷移（P＜0.05），及EPCs的成血管能力（P＜0.05）；中和抗體實驗證明條件培養(yǎng)基中的SDF-1，TGF-β和PDGF-BB是促進遷移的關(guān)鍵細胞因子，而TGF-β，VEGF，PDGF-BB則是促進EPCs成血管的關(guān)鍵細胞因子。
　　第四部分、仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架調(diào)控單核細胞的信號轉(zhuǎn)導機制研究
　　1)硅化膠原支架材

17、料對不同類型的骨缺損修復均有良好的應用，在大鼠股骨部分缺損的動物模型中，材料能夠明顯的促進血管與骨的再生（P＜0.05），缺損局部形成了更多的血管結(jié)構(gòu)和更多的小梁骨結(jié)構(gòu)（P＜0.05），表明其具有明顯的促進愈合和骨重建的作用；免疫熒光雙標的結(jié)果顯示，缺損區(qū)域有更多的CD31+Emcn+雙陽性的血管生成（P＜0.05），同時表達更多的TRAP+的單核細胞（P＜0.05），單核細胞的PDGF-BB分泌也明顯增多（P＜0.05）。
　　

18、2)在體外實驗中，硅化膠原支架材料刺激后，單核細胞的P38和ERK1/2被激活；使用通路抑制劑分別抑制P38和ERK1/2后，發(fā)現(xiàn)單核細胞向TRAP陽性細胞的分化和相關(guān)細胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB）的分泌水平明顯下降（P＜0.05），其與支架材料共培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基促進細胞遷移和EPCs成血管的能力也明顯下降（P＜0.05）；進一步的體內(nèi)實驗研究表明，在P38抑制后，大鼠股骨缺損局部形成的CD31+Emcn

19、+雙陽性的血管明顯減少（P＜0.05），TRAP陽性單核細胞的數(shù)目以及單核細胞表達PDGF-BB的水平也明顯降低（p均＜0.05），表明硅化膠原支架材料能夠通過激活 P38信號通路來進一步促進單核細胞的分化和分泌能力，從而影響骨缺損修復的進程。
　　3.結(jié)論
　　1)仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料表現(xiàn)出了低免疫原性的特征，能夠使宿主的免疫炎癥反應控制在較低的水平范圍內(nèi)，并且不會引起局部組織的炎癥細胞浸潤以及循環(huán)炎癥細胞和炎癥因子

20、的上升，具有良好的生物相容性，在生物應用方面具有明顯的優(yōu)勢。
　　2)纖維內(nèi)仿生硅化膠原支架能夠應用于不同類型的骨缺損修復（小鼠顱骨缺損，大鼠股骨部分缺損），可以促進缺損局部的血管再生和骨重建，具有良好的骨缺損修復效果。
　　3)在骨缺損的修復早期，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠通過對單核細胞P38信號通路的激活，促進單核細胞向TRAP陽性單核細胞分化，分泌更多的相關(guān)細胞因子（SDF-1，TGF-β，VEGF，PDGF-BB

21、）；一方面能夠促進局部的血管生成，尤其是形成更多的CD31+Emcn+雙陽性血管，更好的促進成骨成血管的協(xié)同作用（Coupling），另一方面能夠募集更多的宿主種子細胞（BMSCs，EPCs）到缺損區(qū)域，從而進一步促進局部的血管生成和骨再生。
　　綜上所述，仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料具有良好的生物相容性，在動物骨缺損模型的修復中表現(xiàn)出了良好的修復效果，能夠明顯促進缺損局部的血管化和骨生成；仿生纖維內(nèi)硅化膠原支架材料能夠通過對單核細