陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用.pdf

1、基因轉(zhuǎn)染可用于治療或緩解多種疾病，已成為基礎(chǔ)和臨床研究中不可缺少的醫(yī)療手段?；蜣D(zhuǎn)染的關(guān)鍵問題在于選擇安全高效的基因載體和轉(zhuǎn)染方法，將核酸物質(zhì)直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)并高效表達(dá)，這也是目前基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的瓶頸所在。非病毒型高分子化合物作為基因載體可以在一定程度上提高基因轉(zhuǎn)染的效率和安全性，其中陽(yáng)離子聚合物具有易于合成、便于改性且可攜帶較多 DNA進(jìn)入細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作基因轉(zhuǎn)染的基因載體。然而陽(yáng)離子聚合物很難輔助DNA直接進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染效率

2、無(wú)法進(jìn)一步提高。同時(shí)，陽(yáng)離子聚合物在細(xì)胞內(nèi)易大量累積并干擾細(xì)胞的正常代謝過程而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這些缺點(diǎn)極大地限制了陽(yáng)離子聚合物在臨床上的應(yīng)用。硅納米線陣列（SN）可以在保持細(xì)胞活性的同時(shí)刺穿細(xì)胞膜甚至細(xì)胞核膜，攜帶諸多生物因子進(jìn)入細(xì)胞乃至細(xì)胞核。且SN具有較好生物相容性，可支持多種細(xì)胞的培養(yǎng)。然而，由于未經(jīng)修飾的SN表面存在硅的氧化層，因此導(dǎo)致DNA負(fù)載量較低，限制了其在基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的應(yīng)用。
　　本論文提出了構(gòu)建以陽(yáng)離子聚合物修飾的

3、硅納米線陣列作為基因轉(zhuǎn)染的材料平臺(tái)并輔以提高負(fù)載量和促進(jìn)表達(dá)等手段的復(fù)合基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)策略，旨在綜合利用硅納米線對(duì)細(xì)胞核的直接刺穿作用和陽(yáng)離子聚合物載體對(duì)核酸的有效結(jié)合與釋放作用，來提高基因轉(zhuǎn)染的效率并盡可能地降低細(xì)胞毒性。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　首先，構(gòu)建了一系列核酸載體陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列。通過化學(xué)修飾的方法將25 kDa的支化聚乙烯亞胺（ PEI）和聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）接枝到硅納米線陣列表面得到

4、PEI修飾的硅納米線陣列（SN-PEI）和PDMAEMA修飾的硅納米線陣列（SN-PDM）；為進(jìn)一步發(fā)揮DNA的負(fù)載和釋放效果及細(xì)胞在材料表面的黏附及脫附，在SN-PDM中引入聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）鏈段獲得聚（N-異丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酸氨基乙酯）（PNIPAAm-co-PDM）修飾的硅納米線陣列（SN-PNIPAAm-PDM）。借助水接觸角測(cè)試、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等手段確定了聚合物

5、的成功接枝并系統(tǒng)地表征了材料的表面特性。同時(shí)進(jìn)一步深入考察了這三種基因轉(zhuǎn)染的材料平臺(tái)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) SN-PEI和 SN-PDM表面能黏附較多的細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的良好鋪展和增殖，表明PEI和PDMAEMA對(duì)SN的修飾能夠有效提高材料的生物相容性，具有被進(jìn)一步用作基因轉(zhuǎn)染材料平臺(tái)的潛力和優(yōu)勢(shì)。而 SN-PNIPAAm-PDM表面無(wú)法維持細(xì)胞的正常活性，生物相容性較差，不適合被用作轉(zhuǎn)染材料。
　　在此基礎(chǔ)上，我們提出了由高效

6、核酸結(jié)合型載體聚乙烯亞胺（PEI）接枝修飾的硅納米線陣列（SN-PEI）作為基因轉(zhuǎn)染材料平臺(tái)，并輔以生物相容性較好的小分子量PEI與DNA的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染體系策略以提高DNA在材料表面上的負(fù)載量從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染效率和安全性。探討并系統(tǒng)地考察了SN-PEI表面氨基密度、DNA在材料表面孵育時(shí)間以及轉(zhuǎn)染復(fù)合物中小分子PEI與DNA的N/P比（PEI中的氮原子與DNA中磷原子的摩爾比）對(duì)基因轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將N/P比為80的小分子PEI

7、（2 kDa）與DNA的混合物孵育在25 kDa PEI接枝時(shí)間為3 h的SN-PEI表面10 min后，體系可實(shí)現(xiàn)最大的轉(zhuǎn)染效率。這一策略有效地提高了基因的轉(zhuǎn)染效率并降低了轉(zhuǎn)染體系的細(xì)胞毒性，然而仍存在一些問題亟需解決，如高分子量 PEI可能存在潛在的細(xì)胞毒性、體系中DNA的負(fù)載量較低還需補(bǔ)加小分子量PEI與DNA的復(fù)合物。
　　為構(gòu)建更加高效和安全的基因轉(zhuǎn)染體系，有效提高基因在進(jìn)入細(xì)胞核后的表達(dá)，我們進(jìn)一步提出了以PDMAEM

8、A修飾的硅納米線陣列為材料平臺(tái)，輔以傳統(tǒng)的鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系的集成策略，以充分利用材料平臺(tái)和鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)點(diǎn)，獲得安全、高效負(fù)載和高量表達(dá)的基因轉(zhuǎn)染途徑。PDMAEMA具有比PEI更好的生物相容性，傳統(tǒng)鈣離子依賴型轉(zhuǎn)染體系能夠有效促進(jìn)DNA的胞內(nèi)釋放和表達(dá)。研究結(jié)果表明當(dāng)鈣離子濃度為100 mM、鈣離子與DNA的復(fù)合物在SN-PDM表面的孵育時(shí)間與為20 min，PDMAEMA聚合時(shí)間為24 h的SN-PDM能夠?qū)崿F(xiàn)基因高效

9、率的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。這個(gè)集成策略為基因傳遞提供了一種嶄新的思路，有望在醫(yī)學(xué)研究和臨床治療中進(jìn)一步廣泛應(yīng)用。
　　綜上所述，在生物相容性好且能夠直接作用于細(xì)胞核的硅納米線陣列表面引入高效的基因載體陽(yáng)離子聚合物PEI與PDMAEMA構(gòu)建的陽(yáng)離子聚合物修飾的硅納米線陣列是基因轉(zhuǎn)染的有效的材料平臺(tái)，這種平臺(tái)不僅能夠支持細(xì)胞的黏附和正常生長(zhǎng)增殖，同時(shí)能夠包容多種傳統(tǒng)的、安全的基因轉(zhuǎn)染方法，最終實(shí)現(xiàn)高效的，集成的，安全的基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)。這種以陽(yáng)離