新型陽(yáng)離子聚合物作為基因載體的可行性研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病是以免疫細(xì)胞、免疫分子等攻擊神經(jīng)系統(tǒng)為主要病理機(jī)制的疾病,可發(fā)生于中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)-肌肉接頭等處,導(dǎo)致神經(jīng)元或軸索損傷、髓鞘脫失、神經(jīng)-肌肉接頭處破壞等病理改變。
　　由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病兼具自身免疫性疾病的復(fù)雜性及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病致死、致殘等嚴(yán)重性的特點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制與治療的研究成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)與焦點(diǎn)。靶向治療以直接作用于受損細(xì)胞而不損傷正常細(xì)胞的理念,越來(lái)越受到人們的重視,包括基因治療

2、、RNA干擾技術(shù)、小分子靶向藥物等。基因治療是指通過(guò)操作遺傳物質(zhì)來(lái)干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程,包括替代或糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂,殺滅病變的細(xì)胞或增強(qiáng)機(jī)體清除病變細(xì)胞的能力等,從而達(dá)到治療的目的。
　　在基因治療過(guò)程中,將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的轉(zhuǎn)基因載體是基因治療能否成功的關(guān)鍵,也是目前基因治療的瓶頸。應(yīng)用于基因治療的載體主要有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,是最早用于被基因治療的重要工具,但存在潛在感染、

3、免疫原性,體內(nèi)不能重復(fù)使用,攜帶目的基因的大小受到限制等缺點(diǎn)。而非病毒載體的陽(yáng)離子聚合物是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其優(yōu)點(diǎn)包括:(1)無(wú)免疫原性,不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng),具有良好的生物相容性;(2)可與DNA或RNA形成納米粒;(3)通過(guò)控制粒徑尺寸和表面性質(zhì)可控制載體的生化特性;(4)可根據(jù)需要靈活設(shè)計(jì)分子結(jié)構(gòu);(5)遺傳物質(zhì)的釋放可做到由聚合物基質(zhì)的降解速率決定;(6)表面大量的陽(yáng)離子基團(tuán),提供了進(jìn)一步功能化的可能。
　　本

4、研究?jī)?nèi)容主要分為兩部分:
　　1.樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物OD-Ds-PAMAM的合成和化學(xué)表征,檢測(cè)其形成納米復(fù)合體的粒徑、zeta-電位、形態(tài)和結(jié)構(gòu)和對(duì)DNA的包裹、保護(hù)能力等;
　　2.OD-Ds-PAMAM載體聚合物的生物學(xué)表征,通過(guò)體外細(xì)胞毒性檢測(cè)及轉(zhuǎn)染試驗(yàn),從中篩選出高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性的載體化合物,并評(píng)價(jià)其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療中的應(yīng)用價(jià)值。
　　第一部分:樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物OD-Ds-PAMAM的合成和化學(xué)

5、表征
　　目的:
　　通過(guò)化學(xué)方法表征OD-Ds-PAMAM與pDNA形成復(fù)合物后的性質(zhì),并進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)DNA的包裹、濃聚、保護(hù)能力。
　　方法:
　　以聚酰胺-胺PAMAM dendrimers為骨架,結(jié)合樹(shù)枝狀分子基源葡聚糖衍生物(Oxidized Dextran,OD-Ds,s=2、3、4),并優(yōu)化合成條件,通過(guò)化學(xué)方法表征產(chǎn)物的性質(zhì)。按照一定的N/P比(N/P比是指陽(yáng)離子聚合物中NH4+與DNA中PO3

6、-的摩爾比例),陽(yáng)離子聚合物OD-Ds-PAMAM與DNA均勻混合形成復(fù)合物后,在ZetaPALS-電位分析儀上測(cè)定納米復(fù)合體的粒徑和表面電荷,電子透射顯微鏡觀察納米復(fù)合體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)研究OD-Ds-PAMAM負(fù)載質(zhì)粒DNA的能力,通過(guò)抗核酸酶降解實(shí)驗(yàn)研究OD-Ds-PAMAM保護(hù)質(zhì)粒DNA的能力。
　　結(jié)果:
　　1.納米材料復(fù)合體的粒徑和zeta-電位
　　OD-Ds-PAMAM/pEGFP

7、-N3納米復(fù)合體粒徑隨著N/P從10到60的增大而減小,穩(wěn)定在140-200nm之間;OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3納米復(fù)合體表面電荷隨著N/P比值的增大而增大,在N/P≥40時(shí),電位趨于穩(wěn)定。
　　2.納米材料復(fù)合物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)
　　通過(guò)透射電子顯微鏡觀察OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3在N/P比為20和40時(shí)形成的納米復(fù)合體粒徑大小不超過(guò)200nm,呈實(shí)心球體,粒子分布均勻,隨著N/P比值增加,球體縮小

8、。
　　3.瓊脂糖凝膠電泳
　　OD-Ds-PAMAM與pEGFP-N3按照N/P比為0.5、1、5、10、20、30、40混合后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果提示OD-D3-PAMAM和pDNA在N/P比為5時(shí)可充分結(jié)合,OD-D4-PAMAM和pDNA在N/P≥1時(shí)即達(dá)到完全結(jié)合,而陽(yáng)性對(duì)照組PEI25KD則在N/P≥10時(shí)才能完全結(jié)合pDNA。
　　4.抗核酸酶實(shí)驗(yàn)
　　可見(jiàn)游離的裸質(zhì)粒DNA分子被DNA酶完全降

9、解,相反,用強(qiáng)離子去污劑SDS解離復(fù)合物,對(duì)分離出的DNA分子進(jìn)行電泳分析,未發(fā)現(xiàn)斷裂或降解的pDNA。說(shuō)明OD-Ds-PAMAM陽(yáng)離子聚合物可以保護(hù)DNA分子免受核酸酶的降解。
　　結(jié)論:
　　共合成3種OD-Ds-PAMAM樹(shù)枝狀陽(yáng)離子聚合物,能有效結(jié)合質(zhì)粒DNA分子,結(jié)合后的復(fù)合物直徑在140-200nm之間,表面帶正電荷,能與細(xì)胞膜結(jié)合并被內(nèi)吞。為評(píng)估OD-Ds-PAMAM在體外的基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性作用提供實(shí)驗(yàn)依

10、據(jù)。
　　第二部分:樹(shù)狀陽(yáng)離子聚合物OD-Ds-PAMAM作為傳輸載體的生物學(xué)表征
　　目的:
　　通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)載體聚合物OD-Ds-PAMAM的細(xì)胞毒性與基因轉(zhuǎn)染能力,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,并從中篩選出毒性低、轉(zhuǎn)染效率高的化合物,為進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)奠定實(shí)驗(yàn)與理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　以市場(chǎng)上應(yīng)用較廣泛、同屬非病毒載體陽(yáng)離子聚合物類的聚乙烯亞胺(Polyethyleimine,PEI)作為陽(yáng)性對(duì)照組,體外

11、培養(yǎng)人胚腎HEK293細(xì)胞和神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細(xì)胞,并制備含有增強(qiáng)型EGFP基因的表達(dá)載體pEGFP-N3,利用噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)研究OD-Ds-PAMAM/PEGFP-N3載體復(fù)合物的細(xì)胞毒性作用。然后分別用OD-Ds-PAMAM和PEI兩種載體將pEGFP-N3轉(zhuǎn)染到不含血清培養(yǎng)和含10％胎牛血清培養(yǎng)基的人胚腎HEK293細(xì)胞和神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后分別于24或36h用倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效果和

12、檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞毒性試驗(yàn):
　　在人胚腎HEK293細(xì)胞和神經(jīng)母瘤SH-SY5Y兩種細(xì)胞系當(dāng)中,均可見(jiàn)OD-Ds-PAMAM系列材料顯示出低毒性,三種材料的細(xì)胞毒性總體上呈現(xiàn)OD-D4-PAMAM>OD-D3-PAMAM>OD-D2-PAMAM的趨勢(shì)。陽(yáng)性對(duì)照組PEI25KD在低濃度時(shí)就開(kāi)始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性,在100μg/ml時(shí)細(xì)胞幾乎全部死亡。OD-D4-PAMAM較對(duì)照組PEI25KD顯示

13、出較低的細(xì)胞毒性,當(dāng)OD-D4-PAMAM納米材料濃度為50μg/ml,細(xì)胞存活率仍有60.6%(HEK293細(xì)胞系中)和71.1%(SH-SY5Y細(xì)胞系中)(p<0.01)。
　　2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn):
　　兩種細(xì)胞中,流式細(xì)胞儀下研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),OD-Ds-PAMAM系列納米材料的轉(zhuǎn)染效率與N/P值有關(guān),當(dāng)N/P值逐漸增加,轉(zhuǎn)染效率隨之增加,而當(dāng)N/P值達(dá)到一定值,表達(dá)量不再增加,處于一段平臺(tái)期后反而下降。人胚腎HEK293中

14、,無(wú)血清轉(zhuǎn)染條件下,三種納米材料的轉(zhuǎn)染效率呈現(xiàn)OD-D2-PAMAM

15、體化合物的轉(zhuǎn)染效率均較無(wú)血清轉(zhuǎn)染有所下降。其中,陽(yáng)性對(duì)照組PEI25KD的轉(zhuǎn)染效率下降幅度明顯,而載體化合物OD-D4-PAMAM在各N/P比值下的轉(zhuǎn)染效率僅輕度下降,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中,無(wú)血清時(shí),最優(yōu)N/P比下的OD-D3-PAMAM(10.1%)遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照組PEI25KD(14.5%)的轉(zhuǎn)染效率,OD-D4-PAMAM的轉(zhuǎn)染效率較高(21.4%)(p<0.01)。在

16、有10%FBS條件下,OD-D4-PAMAM載體化合物在最優(yōu)N/P比的轉(zhuǎn)染效率較無(wú)血清轉(zhuǎn)染有所增高(27.7%),超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照組PEI25KD轉(zhuǎn)染效率的2倍(12.2%),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　結(jié)論:
　　明確了OD-Ds-PAMAM系列納米材料的細(xì)胞毒性作用及基因轉(zhuǎn)染效率,證實(shí)納米載體聚合物OD-D4-PAMAM具有較低的細(xì)胞毒性,且在有無(wú)血清存在時(shí),均有較高的轉(zhuǎn)染效率,可以作為HEK293細(xì)胞系和S