NaCl濃度和pH值變化對陰溝腸桿菌腐胺代謝的影響及作用機制研究.pdf

1、生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱。人體攝入過多的生物胺會產(chǎn)生不良的生理反應(yīng)，嚴重會威脅生命。腐胺是食物中最常見的生物胺之一，它不僅能造成食品的腐敗味，而且能增強其它生物胺的毒理學(xué)反應(yīng)，也是致癌物亞硝胺形成的前體。研究報道食品中生物胺的產(chǎn)生主要由污染的腐敗菌代謝而來，并且其代謝途徑也受環(huán)境因素的影響。因此闡明環(huán)境條件如何影響食品中腐敗菌的生物胺產(chǎn)生能力，降低生物胺的累積量具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌是雞肉中

2、的優(yōu)勢腐敗菌，并且代謝產(chǎn)生大量的腐胺。本研究以陰溝腸桿菌C4為研究對象，在解析該菌的腐胺代謝途徑的基礎(chǔ)上，研究食品加工中兩個主要的環(huán)境因子（pH、NaCl濃度）的變化對該菌腐胺產(chǎn)生的影響及作用機制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別加入0.5％精氨酸和0.5％鳥氨酸這兩種不同的底物，將活化好的菌液按1％接種量接種于不同的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)，在不同時間段測定菌液的OD值、pH值和腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)，加

3、入鳥氨酸的菌液中腐胺積累量要遠高于加入精氨酸菌液的積累量。因此，陰溝腸桿菌中腐胺的產(chǎn)生主要通過鳥氨酸的代謝過程完成，而由精氨酸產(chǎn)生的腐胺含量極少。⑵配制含有0.5％鳥氨酸的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)，將pH分別調(diào)為9、8、5、4并滅菌。將活化好的菌種按1％接種量接種于不同的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)，在不同時間段測定菌液的OD值、pH值、鳥氨酸含量及腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)隨著pH值的降低陰溝腸桿菌的生長曲線幾乎一致，但是最終上清液中鳥氨酸的含量逐漸降

4、低，腐胺積累量逐漸升高。然后分析了不同初始pH處理下陰溝腸桿菌在對數(shù)期時與腐胺產(chǎn)生相關(guān)的三個基因（鯡精胺酶基因（agm）、精氨酸脫羧酶基因(arg)和鳥氨酸脫羧酶基因（orn））的表達量變化，發(fā)現(xiàn)agm和arg基因的表達量隨著pH的改變沒有顯著變化，而orn基因的表達量隨pH的升高顯著降低。這說明陰溝腸桿菌在酸性條件下代謝鳥氨酸產(chǎn)生大量的腐胺，并且與鳥氨酸脫羧酶基因表達量的增加有關(guān)。⑶配制0.5％鳥氨酸的培養(yǎng)基(pH4)，然后加入0％、

5、2％、4％、6％、8％的NaCl并滅菌。將活化好的菌種按1％接種量接種于不同的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)數(shù)小時，在不同時間段測定菌液的OD值、pH值、鳥氨酸含量及腐胺積累量。研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的升高，陰溝腸桿菌的生長和腐胺的產(chǎn)量會受到不同程度的抑制，其中4％NaCl濃度會抑制該菌前期生長但是后期生長正常，但是在該條件下腐胺積累量一直沒有增加。利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析了不同NaCl條件下該菌在對數(shù)期時鯡精胺酶基因（

6、agm），精氨酸脫羧酶基因（arg）和鳥氨酸脫羧酶基因（orn）的表達量變化，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度的升高會顯著抑制orn基因的表達量。綜上，高鹽濃度會抑制陰溝腸桿菌的生長和腐胺的產(chǎn)生，但是低鹽濃度下陰溝腸桿菌雖然繼續(xù)生長，但腐胺積累量卻大幅下降，主要是由于鳥氨酸脫羧酶基因的表達量受到抑制造成的。⑷體外重組表達了陰溝腸桿菌鳥氨酸脫羧酶并分析了該酶活受環(huán)境因子變化的影響，對鳥氨酸脫羧酶的米氏常數(shù)(Km)、最大反應(yīng)速率(Vm)、最適pH、最適溫度

7、等進行了研究，同時也研究了NaCl濃度對酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)鳥氨酸脫羧酶的Km為1.666 mM，Vmax為6.398 U/mg。最適溫度為30℃，最適pH為6.0。NaCl濃度為1.5％時鳥氨酸脫羧酶活性要略高于其它組。綜上，陰溝腸桿菌在低pH脅迫條件下，腐胺積累量高而酶的活性很弱，說明腐胺的產(chǎn)生主要是由于菌株內(nèi)鳥氨酸脫羧酶基因的大量表達引起的。腐胺的產(chǎn)生還會隨NaCl濃度的升高而受到抑制，原因是NaCl濃度升高除了抑制菌株的生長外