組蛋白磷酸化和tRNA甲基化相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本論文主要研究組蛋白修飾和tRNA修飾相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。
　　論文的前兩章介紹了人源蛋白MCPH1串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能。MCPH1蛋白參與到DNA損傷修復(fù)過程中，它含有三個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域，其中位于N端的第一個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域與染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI-SNF結(jié)合，并把SWI-SNF復(fù)合物帶到DNA損傷位點(diǎn)，使緊密的染色質(zhì)變的松散;位于C-端的第二個(gè)和第三個(gè)BRCT結(jié)構(gòu)域?qū)儆诖?lián)BRCT結(jié)構(gòu)域，他被證實(shí)參與結(jié)合磷酸化的組蛋

2、白變異體H2AX(γH2AX)。γH2AX發(fā)生在DNA修復(fù)反應(yīng)的早期并引發(fā)了下游的修復(fù)過程，在DNA的損傷修復(fù)過程中扮演著重要角色。在本論文中，通過采用X射線晶體學(xué)和生物化學(xué)相結(jié)合的方法，我們研究MCPH1串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域識(shí)別γH2AX的分子機(jī)制。首先我們用熒光偏振的方法測定了MCPH1串聯(lián)BRCT與γH2AX小肽的親和力，結(jié)果表明它們之間有很強(qiáng)的的相互作用。然后，我們分別解析了串聯(lián)BRCT以及它與γH2AX小肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并與

3、其他經(jīng)典的串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)相比較，我們的結(jié)構(gòu)顯示MCPH1采用一種新的RXXN motif代替RXXK motif來識(shí)別γH2AX。此外，MCPH1對(duì)磷酸化+3位的殘基（Tyr，位于小肽的C末端）有選擇性，它傾向于結(jié)合C末端有COOH基團(tuán)的小肽，C-末端的氨基化明顯減弱了它們的相互作用。我們進(jìn)一步證明MCPH1串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域與內(nèi)源性的γH2AX有相互作用。我們的研究揭示了MCPH1串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域識(shí)別γH2AX的分子機(jī)理。

4、　　論文的后兩章介紹了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）tRNA m1G9甲基轉(zhuǎn)移酶scTrm10的酶活催化機(jī)制。tRNA的甲基化是一種很普遍的修飾，這種修飾對(duì)tRNA的生物學(xué)功能是必需的。然而鳥嘌呤G的N-1甲基化(m1G)在tRNA修飾中卻比較罕見，目前在兩個(gè)位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了m1G甲基化:位于anti-codon附近的m1G37和位于D-loop和acceptor stem連接處的m1G9。據(jù)最近的文獻(xiàn)報(bào)道，T

5、rm10家族蛋白被發(fā)現(xiàn)與tRNA m1G9的形成有關(guān)，但是，該反應(yīng)的催化機(jī)制以及Trm10與底物tRNA的結(jié)合機(jī)制尚不清楚。在本工作中，我們解析了釀酒酵母scTrm10與小分子底物SAH的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。通過拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，我們發(fā)現(xiàn)scTrm10的酶活結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟POUT甲基轉(zhuǎn)移酶家族。因?yàn)槟壳耙阎腟POUT家族甲基轉(zhuǎn)移酶都是同二聚體，所以我們使用X射線小角散射(SAXS)的方法研究了裂殖酵母spTrm10的溶液結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明spTrm

6、10在溶液中呈現(xiàn)單體狀態(tài)，而且它的N端區(qū)域在溶液中非?；钴S。通過體外的酶活實(shí)驗(yàn)、ITC實(shí)驗(yàn)和分子docking結(jié)果，我們猜測兩個(gè)保守殘基參與了甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng):D210可能在酶活反應(yīng)充當(dāng)著轉(zhuǎn)移甲基的作用，而Q118則與tRNA G9有直接的相互作用。進(jìn)一步，我們用EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了scTrm10的N端區(qū)域和酶活結(jié)構(gòu)域的堿性區(qū)域都可以識(shí)別tRNA。通過該研究，我們第一次報(bào)道了釀酒酵母scTrm10的晶體結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步分析了它催化tRNA m1