超高壓處理酪蛋白體外模擬消化及其產(chǎn)物的生物利用度評價.pdf

1、酪蛋白(casein)是牛乳中主要的蛋白之一，其消化后能產(chǎn)生許多具有生理功能的活性肽，如阿片樣肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗菌肽、抗血栓肽、礦物元素結(jié)合肽等，除此之外，近幾年還發(fā)現(xiàn)抗炎肽，這些成分的發(fā)揮無疑是有益于人們的健康。但是酪蛋白是導(dǎo)致嬰幼兒牛乳過敏主要的過敏原之一，其主要的臨床表現(xiàn)為皮膚癥狀，如蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫、濕疹;其次是胃腸道表現(xiàn)。除此之外，酪蛋白是幾種含磷蛋白的復(fù)合體，以膠束狀態(tài)存在于乳中，呈現(xiàn)為粗糙的球

2、形粒子，很大程度上導(dǎo)致了牛乳蛋白在嬰兒胃內(nèi)的難消化性。因此，降低酪蛋白的過敏反應(yīng)和促進其水解具有重要意義。超高壓技術(shù)作為一種新型的非熱殺菌技術(shù)，可以破壞蛋白的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)，改變蛋白構(gòu)象，提高蛋白質(zhì)的可消化性和降低其過敏反應(yīng)。本課題旨在利用超高壓處理技術(shù)，采用不同的壓力、溫度、時間和超高壓次數(shù)來處理乳源酪蛋白，并體外模擬消化，探討酪蛋白在不同條件下的消化及其過敏性反應(yīng)的情況，并且采用正交設(shè)計分別得到降低酪蛋白過敏和促進水解的最佳高

3、壓次數(shù)、壓力、時間、溫度。采用Caco-2單層細胞模型，對經(jīng)過超高壓處理后的酪蛋白肽進行生物利用度評價。
　　目的:
　　1.采用正交設(shè)計對乳源酪蛋白進行超高壓處理，分析降低乳源酪蛋白抗原性的最佳處理條件。
　　2.采用正交設(shè)計對乳源酪蛋白進行超高壓處理，分析促進乳源酪蛋白水解度的最佳處理條件。
　　3.對超高壓處理結(jié)合模擬成人和嬰兒胃腸消化條件獲得酪蛋白肽進行生物利用度評價。
　　方法:
　　1.制

4、備酪蛋白溶液，以壓力、溫度、保壓時間、高壓循環(huán)次數(shù)四個處理因素進行超高壓試驗，并對處理后的酪蛋白體外模擬成人、嬰兒胃腸消化條件進行消化，以酪蛋白抗原消減結(jié)果為指標進行單因素試驗和正交設(shè)計來對超高壓處理后酪蛋白消化水平條件進行優(yōu)化，來獲得最佳的壓力、溫度、保壓時間、高壓循環(huán)次數(shù)組合，采用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定乳源酪蛋白抗原性。
　　2.制備酪蛋白溶液，以壓力、溫度、保壓時間、高壓循環(huán)次數(shù)四個處理因素進行超高壓試驗，并對處理后的酪蛋白

5、體外模擬成人、嬰兒胃腸消化條件進行消化，以水解度為指標進行單因素試驗和正交設(shè)計來對超高壓處理后酪蛋白消化水平條件進行優(yōu)化，來獲得最佳的壓力、溫度、保壓時間、高壓循環(huán)次數(shù)組合，采用三硝基苯磺酸法測定乳源酪蛋白的水解度。
　　3.MTT法檢測6種不同處理條件下產(chǎn)生的酪蛋白肽對Caco-2細胞毒性的影響。
　　4.建立Caco-2單層細胞模型。測定Caco-2細胞跨膜電阻值、熒光素鈉標志物的吸收轉(zhuǎn)運以及堿性磷酸酶活性的表達，采用上

6、述方法對所建立的Caco-2單層細胞模型進行綜合評價，并將Caco-2單層細胞模型用于酪蛋白肽生物利用度評價。
　　5.乳源酪蛋白經(jīng)過超高壓處理及其模擬胃腸消化后，測定酪蛋白肽在Caco-2單層細胞模型中肽氮的吸收率，評價處理后乳源酪蛋白的生物利用度。
　　結(jié)果:
　　1.超高壓處理乳源酪蛋白之后，分別模擬成人、嬰兒胃腸消化條件對乳源酪蛋白超高壓處理樣本進行消化。結(jié)果表明，超高壓對乳源酪蛋白抗原性均有消減作用，超高壓結(jié)

7、合模擬成人胃腸消化條件的最佳參數(shù)是:壓力350MPa、溫度30℃、保壓時間15min、高壓3次，抗原抑制率為22.67％;超高壓結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化條件的最佳參數(shù)是:壓力350MPa、溫度30℃、保壓時間20min、高壓1次，抗原抑制率為39.95％。
　　2.超高壓處理乳源酪蛋白之后，分別模擬成人、嬰兒胃腸消化條件對乳源酪蛋白超高壓處理樣本進行消化。結(jié)果表明，超高壓對乳源酪蛋白水解度均有促進作用，超高壓結(jié)合模擬成人胃腸消化條件的

8、最佳參數(shù)是:壓力350MPa、溫度35℃、保壓時間30min、高壓2次，水解度為12.68％;超高壓結(jié)合模擬嬰兒胃腸消化條件的最佳參數(shù)是:壓力300MPa、溫度30℃、保壓時間35min、高壓2次，水解度為11.52％。
　　3.MTT結(jié)果表明，在實驗所用的劑量范圍內(nèi)，不同處理條件下的酪蛋白肽作用于Caco-2細胞24h，酪蛋白肽對Caco-2細胞無細胞毒性作用。
　　4.Transwell細胞培養(yǎng)板中每孔Caco-2細胞的

9、電阻值均大于500Ω·cm2，第19天和21天時，其熒光素鈉的表觀滲透系數(shù)(Papp)均分布在0.1～0.7×10-6cm/s范圍內(nèi)，堿性磷酸酶AP側(cè)/BL側(cè)為5.32，說明Caco-2細胞在Transwell細胞培養(yǎng)板中形成完整致密的單層細胞膜。
　　5.在模擬成人胃腸消化條件下，對照組酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率為7.26％，水解度最優(yōu)組的酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率最高，為9.44％，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。消減抗原最優(yōu)

10、組的酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率為7.88％，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在模擬嬰兒胃腸消化條件下，對照組酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率為5.76％，水解度最優(yōu)組和抗原消減最優(yōu)組的酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率明顯高于對照組（P＜0.05），且水解度最優(yōu)組的酪蛋白肽轉(zhuǎn)運吸收率最高，為6.94％。
　　結(jié)論:
　　本研究通過正交設(shè)計獲得消減乳源酪蛋白抗原性和增加乳源酪蛋白水解度最優(yōu)超高壓處理參數(shù)，模擬成人和嬰兒胃腸消化條件對超高壓處理乳源酪蛋