蜜炙黃芪多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡的實驗研究.pdf

1、背景：近年來，從天然藥材中分離與提取有效的抗腫瘤活性成分，可能成為一種腫瘤治療的新策略，引起研究者們的極大關(guān)注。黃芪是天然藥材中研究最多的，其主要有效化學(xué)成分包括：黃芪多糖(astragalus polysaccharides.APS)、黃芪皂苷(astragaloside)、黃芪黃酮（astragalus flavone）等。黃芪多糖是具有廣泛藥理作用的活性物質(zhì)，如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、治療心血管疾病及糖尿病等。蜜炙黃芪多糖（honey-

2、processing Astragalus polysaccharides，HP-APS）是黃芪經(jīng)過蜜炙后所提取的多糖，與APS相比較，HP-APS生物活性及藥效得以提高。黃芪多糖的抗腫瘤作用可通過免疫調(diào)節(jié)功能實現(xiàn)，推測腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡可能是免疫調(diào)節(jié)類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵機(jī)制。因此，本課題主要探究HP-APS與APS對腫瘤細(xì)胞的免疫原性的影響及其抗腫瘤分子機(jī)制相關(guān)性研究。
　　目的：考察蜜炙黃芪多糖及黃芪多糖的抗腫瘤免疫活性及其

3、對腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡影響。
　　方法：
　　1.采用水提醇沉法提取蜜炙黃芪多糖，通過凝膠色譜進(jìn)一步分離純化，硫酸苯酚比色法測定黃芪多糖和蜜炙黃芪多糖的含量。
　　2.采用CCK8法檢測HP-APS和APS對人的肺癌細(xì)胞A549，小鼠的結(jié)腸癌細(xì)胞MC38，小鼠的黑色素瘤細(xì)胞B16的細(xì)胞增殖的影響。
　　3.采用Annexin V與7AAD聯(lián)合染色，檢測HP-APS和APS對A549、MC38、B16的凋亡影響，

4、同時采用PI染色法檢測其對A549細(xì)胞的周期影響。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HP-APS和APS對A549、MC38、B16的鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）表達(dá)的影響，及其對A549、MC38、B16細(xì)胞MHC-I,CD86，CD80分子的表達(dá)影響。
　　5.采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）測定HP-APS和APS對A549、MC38、B16細(xì)胞的免疫原性死亡信號分子三磷酸腺苷( ATP)釋放的影響。<

5、br>　　6.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HP-APS和APS對小鼠細(xì)胞系DC2.4和小鼠原代DC細(xì)胞的表面標(biāo)志的表達(dá)水平的影響。
　　7.構(gòu)建C57/B6小鼠的B16細(xì)胞的黑色素移植瘤動物模型，分別研究HP-APS對荷瘤小鼠腫瘤體積及瘤重的影響
　　結(jié)果：
　　1.分離純化得到黃芪多糖和蜜炙黃芪多糖的含量分別為:67.22％±0.58%與69.81±0.76%。
　　2.HP-APS和APS在濃度為5mg/mL-10mg

6、/mL這濃度范圍內(nèi)對A549、MC38、B16的均顯示了細(xì)胞毒性作用，并且呈一定的濃度依賴性。當(dāng)HP-APS濃度提高為10mg/mL時，對A549、MC38、B16最大的抑制率分別為：48.90±0.98%、42.60±0.89%、48.40±1.35%。
　　3.HP-APS在5mg/mL-10mg/mL的濃度范圍內(nèi)均可促進(jìn)A549、MC38、B16的凋亡。當(dāng)HP-APS的濃度為10mg/mL時，各細(xì)胞株凋亡率分別為：18.8%

7、，9.82和12.9%；在相同濃度下，HP-APS對A549細(xì)胞在G0/G1期的含量為：60.3±3.48%。
　　4.HP-APS能夠促進(jìn)A549細(xì)胞表面的CRT、MHC-I及Hsp70分子的表達(dá)顯著升高。當(dāng)HP-APS的濃度為10mg/mL時，CRT、MHC-I及Hsp70在A549細(xì)胞表面表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度分別為388.80±9.60、4734.66±58.58、494.66±18.58，與空白對照組有顯著性差異（P＜0.0

8、5）。HP-APS亦能促進(jìn)MC38和B16細(xì)胞表面的CRT、MHC-I，CD86的表達(dá)，且與空白組相比，差異顯著（P＜0.05）。
　　5.HP-APS能促進(jìn)小鼠DC2.4細(xì)胞表面的CD80、CD86及MHC-I表達(dá)提高。當(dāng)濃度為10mg/mL時其相對應(yīng)的熒光表達(dá)強(qiáng)度為：805.00±10.53、1433.02±23.02、128.00±6.53。HP-APS在濃度為10mg/mL時，與空白組比較，能顯著增強(qiáng)小鼠骨髓DC細(xì)胞表面的

9、CD11c、CD80及MHC-I的表達(dá)，相對應(yīng)的熒光強(qiáng)度分別為：22628.00±116.32、11390.33±123.55、118.00±4.32。
　　6.經(jīng)ELISA測定HP-APS對A549、MC38、B16細(xì)胞中ATP的釋放,在5mg/mL至10mg/mL的濃度范圍內(nèi)，ATP的釋放量與濃度呈線性關(guān)系，當(dāng)濃度為10mg/mL時，ATP的釋放量分別為：3834.38±24.59、3021.53±96.80、2276.53±

10、43.84。
　　7.HP-APS的體內(nèi)作用表明，實驗組在小鼠腫瘤體積，瘤重顯著降低，腫瘤生長速度明顯較緩慢。
　　結(jié)論：HP-APS和APS能誘導(dǎo)相關(guān)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡。其機(jī)制可能是通過增強(qiáng)ATP、HSP70、CRT表達(dá)誘導(dǎo) A549的免疫原性死亡，提高M(jìn)HC-I、CD86和CD80的表達(dá)，誘導(dǎo)A549、MC38、B16細(xì)胞的凋亡，阻滯A549細(xì)胞于G0/G1期。以及促進(jìn)小鼠骨髓DC細(xì)胞的成熟，更進(jìn)一步活化抗原提呈細(xì)胞