基于磁性材料固定酶的微波酶解新技術(shù).pdf

1、本文研究了以功能磁性納米材料固定酶為基礎(chǔ)的微波輔助快速酶解新方法。發(fā)展了一系列新的在納米磁性微球表面固定酶的簡便方法,并利用納米磁球能高效吸收微波輻射能量的優(yōu)點,將蛋白酶固定在合成好的納米微球上,在微波輻射下,極大的提高了蛋白酶解的效率。相比于傳統(tǒng)的溶液酶解方法,該酶解技術(shù)將蛋白酶解所需時間從12小時縮短至15秒,而且酶解效果優(yōu)于傳統(tǒng)的溶液酶解方法。在微波輻射的幫助下,甚至連微克級的蛋白也能被有效酶解并鑒定。為了進一步驗證該方法的實用性

2、,復(fù)雜生物樣品----鼠肝全蛋白提取物用該方法在15秒內(nèi)進行了酶解也顯示了非常好的效果。此外,利用一個外加磁鐵,固定在磁球上的酶還能被回收利用。本研究分為四個部分：
　　 第一章介紹了選題的背景、意義。介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和酶解在這一蓬勃發(fā)展領(lǐng)域的重要性和最新技術(shù)進展。進而提出,以固定酶為基礎(chǔ)的酶解技術(shù)已經(jīng)成為了一個快速或在線酶解的趨勢,而微波輔助酶解則因為其簡便有效的操作性而受到越來越多的人的關(guān)注。二者的結(jié)合鮮有報道,也

3、僅局限于標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
　　 第二章研究了以四氧化三鐵磁球固定酶為基礎(chǔ)的微波輔助酶解技術(shù)。以γ-縮水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)為偶聯(lián)劑,只需一步反應(yīng)就可以將胰蛋白酶固定在磁球上。且四氧化三鐵磁球合成簡單,磁響應(yīng)性良好。將這一固定酶與微波輔助酶解技術(shù)相結(jié)合,所產(chǎn)生肽段用MALDI-TOF MS進行鑒定。結(jié)果顯示極短時間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)蛋白就得到了的有效酶解。然后考察不同條件下酶解的完全性和效率。最后將這一微波酶解方法應(yīng)用到“Top-

4、Down”技術(shù)路線中,酶解了鼠肝蛋白提取物的反相分離流份。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示這一方法對實際樣品表現(xiàn)出了極好的可行性。
　　 第三章考慮到四氧化三鐵磁球表面活性羥基基團少從而導(dǎo)致酶負(fù)載量較低的問題,改進了磁性載體。發(fā)展了先在四氧化三鐵磁球表面包覆硅層,然后再在磁性硅球表面鍵合GLYMO的方法。通過測定發(fā)現(xiàn)酶的負(fù)載量提高了3-4倍。類似的用磁性硅球微波酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白,優(yōu)化反應(yīng)條件。然后將這一優(yōu)化之后的條件應(yīng)用到未經(jīng)過任何預(yù)分離的鼠肝全蛋

5、白。15秒的微波酶解之后,直接進行LC-ESI-MS/MS分析。整個分析過程只有1個小時,在99％可信度下鑒定了318個蛋白,達(dá)到了與傳統(tǒng)溶液酶解方法相當(dāng)?shù)男Ч?但時效性大大增強。這一結(jié)果證明了磁性材料微波酶解技術(shù)的巨大潛力,它大大增進了蛋白質(zhì)組學(xué)的通量性,并且展示了其在臨床診斷應(yīng)用上的前景。
　　 第四章發(fā)展了另一種氨基納米磁球固定酶的方法,該氨基納米磁球合成工藝簡單,比表面積大,進一步提高了固定酶的量,且克服了磁性硅球合成工