L-RADA16-RGD自組裝短肽納米羥基磷灰石復(fù)合材料制備、生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　制備L-RADA16-RGD自組裝短肽納米羥基磷灰石復(fù)合材料，利用L-RADA16-RGD材料所形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞增殖粘附，利用RGD基團(tuán)促進(jìn)成骨分化，燒結(jié)成多孔納米羥基磷灰石提供一定強(qiáng)度的力學(xué)支持。通過(guò)材料學(xué)檢測(cè)、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分析評(píng)價(jià)復(fù)合材料其結(jié)構(gòu)構(gòu)成、測(cè)試其性能、觀察其體內(nèi)外的生物安全性、生物相容性及生物活性。
　　方法：
　?、艑HA與發(fā)泡劑按50:1比例進(jìn)行研磨混合，將混合物在1500℃的高

2、溫條件下燒結(jié)5小時(shí)。將燒結(jié)后的nHA多孔材料采用不同模具制備力學(xué)樣條、小方片、小圓片，再與液態(tài) L-RADA16-RGD按體積比1:1混合。使用掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)，透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察材料表征。⑵按照上述方法制備L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料，將小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(MC3T3-E1)與復(fù)合材

3、料進(jìn)行共培養(yǎng)，通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞周期來(lái)評(píng)價(jià)該復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞的生物相容性及細(xì)胞毒性。⑶將MC3T3-E1細(xì)胞與nHA/L-RADA16-RGD復(fù)合材料所制備的小圓片在6孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)MC3T3-E1行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot, WB)檢測(cè)I型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)該生物材料的生物活性。⑷在SD大鼠外側(cè)股骨髁建立骨缺

4、損模型，分別植入由nHA/L-RADA16-RGD復(fù)合材料所制備的多孔骨填充材料及單純多孔nHA骨填充材料，觀察點(diǎn)設(shè)置為填充材料植入后30天、60天。采用微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro computed temography, Micro-CT)及組織學(xué)染色觀察植入材料周圍骨生長(zhǎng)情況、植入材料與骨的界面結(jié)合情況，同時(shí)進(jìn)行動(dòng)物肝腎功生化指標(biāo)檢測(cè)、肝腎組織學(xué)檢測(cè)，以綜合評(píng)價(jià)L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料的生物安全性、生物相容性

5、及生物活性。
　　結(jié)果：
　　①通過(guò)SEM與TEM觀察所制備的樣本可見(jiàn)多孔材料表征，驗(yàn)證L-RADA16-RGD多肽材料成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),觀察到L-RADA16-RGD多肽與多孔nHA材料進(jìn)行物理結(jié)合，L-RADA16-RGD多肽在多孔nHA孔隙之間形成三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),孔隙率71.95±1.77%，孔徑大小為203±17nm。②通過(guò)CCK-8檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞與L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料共培養(yǎng)后的細(xì)

6、胞增殖情況，通過(guò)與多孔nHA材料組及空白對(duì)照組對(duì)比，可以得知三組的細(xì)胞增殖情況隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì)，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，三組細(xì)胞的增殖情況相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。另外，流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期提示，L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組、多孔nHA材料組及空白對(duì)照組在不同觀察時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期情況分別為：各組中的第1天及第7天細(xì)胞周期情況相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而第4天的細(xì)胞周期檢測(cè)中，L-RADA

7、16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組處于S期及M期的細(xì)胞明顯多于多孔nHA材料組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③MC3T3-E1細(xì)胞在與L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料共培養(yǎng)，經(jīng)21天成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過(guò)茜素紅染色染色觀察發(fā)現(xiàn)，肉眼觀 L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組的染色較多孔 nHA材料組及對(duì)照組顏色更深，鏡下觀L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組鈣結(jié)節(jié)生成的數(shù)量亦明顯多于

8、多孔nHA材料組及對(duì)照組。將復(fù)合材料表面的染料洗脫并進(jìn)行定量檢測(cè)，L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組、多孔nHA材料組及對(duì)照組的吸光度分別為：0.37±0.04、0.22±0.01、0.19±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。WB檢測(cè)各成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平提示，在各觀察時(shí)間點(diǎn)，L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組各成骨蛋白表達(dá)水平高于多孔nHA材料組及對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。④在骨

9、缺損模型的分析中，Micro-CT分析結(jié)果提示，在兩個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組及多孔 nHA材料組植入物周圍的骨小梁體積(BV)、骨小梁相對(duì)體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb. N)、骨小梁厚度(Tb. Th)、骨小梁分離度(Tb. Sp)分別為：。其中BV、BV/TV、Tb. N、Tb. Th四組數(shù)據(jù)中，L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組高于多孔 nHA材料組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

10、P＜0.05)。硬組織切片染色提示兩組植入物孔內(nèi)均有較好的骨長(zhǎng)入，骨與植入物界面結(jié)合緊密，但L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料組植入物孔內(nèi)骨長(zhǎng)入情況更優(yōu)。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)上述方法成功制備多孔nHA。通過(guò)加入L-RADA16-RGD，使復(fù)合材料的生物相容性及生物活性得到了提高。L-RADA16-RGD納米羥基磷灰石復(fù)合材料在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的生物安全性、生物相容性及生物活性，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值及前景。