過氧化物酶和谷胱甘肽的單細(xì)胞分析及DNA的單分子檢測.pdf

1、第一章主要對毛細(xì)管電泳、微流控芯片和掃描電化學(xué)顯微鏡的單細(xì)胞分析及單細(xì)胞高通量分析作了簡要的綜述。在毛細(xì)管電泳單細(xì)胞分析中，涉及到單細(xì)胞進(jìn)樣，細(xì)胞溶膜，細(xì)胞內(nèi)組分的衍生(包括柱前衍生，柱上衍生，柱后衍生)和檢測技術(shù)(包括電化學(xué)法和激光誘導(dǎo)熒光法)。此外對細(xì)胞內(nèi)衍生技術(shù)及細(xì)胞電穿孔技術(shù)在毛細(xì)管電泳單細(xì)胞分析中的應(yīng)用也作了敘述。在微流控芯片單細(xì)胞分析中，著重介紹了單細(xì)胞組分分析及單細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的實時檢測。本章也對掃描電化學(xué)顯微術(shù)在單細(xì)胞分

2、析中的應(yīng)用及高通量單細(xì)胞分析也作了概述。本章共引用文獻(xiàn)142篇。 第二章中我們提出了一種文獻(xiàn)中未見報道的高通量電化學(xué)測定單個細(xì)胞中酶的新策略。首先利用毛地黃皂苷能溶解細(xì)胞膜上膽固醇的性質(zhì)，使細(xì)胞膜上形成微孔，只有小分子物質(zhì)(如酶的底物和產(chǎn)物)可以通過這些微孔進(jìn)出細(xì)胞，而大分子物質(zhì)(如酶)不能穿過細(xì)胞膜。在毛細(xì)管中加入緩沖液和酶反應(yīng)的底物氫醌(H<,2>Q)和過氧化氫(H<,2>O<,2>)。用壓力將細(xì)胞逐個連續(xù)壓入毛細(xì)管，H<,

3、2>Q和H<,2>O<,2>通過細(xì)胞微孔擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞與酶發(fā)生催化反應(yīng)。生成的苯醌(BQ)又?jǐn)U散出細(xì)胞。細(xì)胞隨著壓力流向檢測端移動，與此同時，在細(xì)胞周圍形成產(chǎn)物BQ的區(qū)帶，當(dāng)區(qū)帶到達(dá)毛細(xì)管出口時，用碳纖維電極檢測。我們用這種方法成功地測定了人中性粒細(xì)胞中過氧化物酶。在32 min內(nèi)可連續(xù)測定39個細(xì)胞。通過分析得到方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為8.7％。其中細(xì)胞不同造成的RSD約為6％。該論文發(fā)表在Anal.Chem.78(2006)，321

4、3-3220。 在第三章，我們建立了一種納升微池中催化反應(yīng)電化學(xué)檢測單細(xì)胞中酶活性的方法。在這個方法中將單細(xì)胞用推片的方法導(dǎo)入到用簡單的化學(xué)方法刻蝕的納升微池陣列中。再將此細(xì)胞用冷凍/解凍方法溶膜。在含有單細(xì)胞溶解液的微池中加入酶反應(yīng)的底物。在反應(yīng)10 min后插入用微米金圓盤工作電極和Ag/AgCl參比電極構(gòu)建成的雙電極。用伏安法測定單細(xì)胞中的酶。整個實驗在自制的恒濕箱中進(jìn)行。此外，文中還討論了溶液蒸發(fā)、電極尺寸、溶液體積、電

5、極污染、單細(xì)胞微池加樣、溶液中溶解氧的影響等因素。用這種方法成功的測定了人單個中性粒細(xì)胞和急性早幼粒白血病細(xì)胞中的過氧化物酶活性。該論文發(fā)表在Anal．Chem.78(2006)，23l-238。 在第四章中我們研究了掃描電化學(xué)顯微術(shù)(SECM)定量測定單個細(xì)胞中酶的方法。雖然單個細(xì)胞的SECM已有很多工作，但是至今還沒有用SECM進(jìn)行細(xì)胞中組分定量測定的報道，這是因為SECM是一種表面測試技術(shù)。為了實現(xiàn)用SECM進(jìn)行定量測定單

6、個細(xì)胞中酶，我們提出了一種新的思路。首先讓細(xì)胞在硅烷化玻片上貼壁，然后用毛地黃皂苷在細(xì)胞膜上形成微孔，加入含酶底物的溶液。此時酶的底物和酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物可以通過這些微孔進(jìn)出細(xì)胞，而酶仍留在細(xì)胞內(nèi)。酶底物通過細(xì)胞微孔擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶發(fā)生催化反應(yīng)。產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散至細(xì)胞外。用SECM的微電極探頭在細(xì)胞上方掃描，得到SECM掃描曲線，曲線的峰高反映了細(xì)胞內(nèi)酶的活性。再用超微注射向細(xì)胞中注入已知濃度的酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用同一探頭在細(xì)胞上方掃描，得

7、到注入酶標(biāo)準(zhǔn)溶液后的SECM曲線掃描。此曲線的峰高反映了細(xì)胞內(nèi)酶及加入標(biāo)準(zhǔn)酶后的總活性。用這種細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)加入法可以定量測定單個細(xì)胞中的酶。用這種方法我們定量測定了人中性粒細(xì)胞中過氧化物酶。這個方法的優(yōu)點是測定的是：(1)細(xì)胞環(huán)境內(nèi)酶的活性；(2)無電極污染；(3)不需要除去溶液中的氧；(4)消除了細(xì)胞間膜的差異對定量的影響。 第五章中我們研究了一種構(gòu)建用于掃描電化學(xué)顯微術(shù)(SECM)探測單個細(xì)胞雙信息的納/微米，微/=微米雙圓

8、盤電極探頭的方法。首先通過化學(xué)刻蝕將半徑10 um的金屬絲刻蝕至納米尺寸。再用電化學(xué)方法在電極表面覆蓋一層絕緣層。然后，一個頂端有納米尺寸的金屬絲(第一個電極)和一個頂端有微米尺寸的金屬絲(第二個電極)插入硼硅玻璃θ管的兩邊。兩根電極放入θ管后，用α-氰基丙烯酸乙脂膠(502膠)密封。微米電極略微探出θ管，納/微米電極置于θ管內(nèi)。最后，θ管分別在細(xì)砂紙、三氧化二鋁粉打磨，直到兩個電極的納/微米及微米頂端露出。因為第二個電極探出θ管，在打

9、磨過程中微米電極自然就形成了。由于電極被雙層絕緣(電化學(xué)聚合絕緣和502膠絕緣)，所以用這種方法制作的雙電極的成功率是很高的。 第六章中我們研究了一種無需細(xì)胞溶膜的高通量檢測單細(xì)胞中組分的方法。在以前所報道的基于微通道(包括毛細(xì)管電泳和微流控芯片)中定量測定細(xì)胞內(nèi)組分的方法都是將細(xì)胞在微通道中溶膜后再進(jìn)行測定。由于細(xì)胞內(nèi)的組分或碎片在微通道中吸附會改變微通道內(nèi)壁的性質(zhì)，常需要每測定一個細(xì)胞后處理微通道。而且每個細(xì)胞溶膜也

10、需要時間。這就使高通量單細(xì)胞帶來困難。為了解決這個問題，我們提出了無需細(xì)胞溶膜的高通量檢測單細(xì)胞中GSH的方法。在該方法中，細(xì)胞在含有衍生試劑萘二甲醛(2，3-naphthaleneicarboxal—dehyde，NDA)的硼砂緩沖溶液中孵育，NDA滲透到細(xì)胞中與GSH反應(yīng)，生成有熒光的化合物。然后將這些細(xì)胞高通量地導(dǎo)入聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片中。在汞燈作為光源激發(fā)下，用電子多級放大電感偶合器(EMCCD)拍攝流過芯片的細(xì)

11、胞。根據(jù)每個細(xì)胞的熒光信號對細(xì)胞內(nèi)的GStH進(jìn)行定量分析。對血紅細(xì)胞分析速度約67 cells/min，對胃癌細(xì)胞分析速度約26cells/min。 第七章中我們研究了共聚焦激光掃描熒光圖像的校正方法并測定了胃癌細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)的分布。在共聚焦激光掃描熒光圖像的校正中，首先利用共聚焦激光掃描顯微鏡對浸泡過羅丹明6G的胃癌細(xì)胞進(jìn)行XYZ三維掃描，得到細(xì)胞內(nèi)羅丹明6G的熒光強度圖像。得到一個相對于細(xì)胞內(nèi)位置不同的熒光強度校正

12、常數(shù)。再將同一個細(xì)胞用NDA衍生細(xì)胞內(nèi)的GSH。在與羅丹明6G同樣掃描條件下，對同一個細(xì)胞進(jìn)行第二次三維掃描。這樣得到的熒光強度圖為細(xì)胞內(nèi)羅丹明6G和GSH熒光強度的總和。通過軟件將兩次掃描圖像相減就得到了細(xì)胞內(nèi)GSH的熒光強度圖像。再通過熒光強度校正常數(shù)校正細(xì)胞內(nèi)GSH的熒光強度，得到細(xì)胞內(nèi)GSH的真實分布圖像。 在第八章中我們提出了一種新的，簡單的測定單分子的體積放大技術(shù)。以DNA作為模型分子。該方法的策略步驟分為三個步驟。

13、第一步取一定量鏈霉親和素修飾的0.35μm的磁球與過量的生物素化的捕捉探針反應(yīng)，用磁分離除去過量的捕捉探針。再用生物素封閉磁球表面未反應(yīng)的鏈霉親和素位點。用磁分離除去過量的生物素。將少量目標(biāo)DNA分子與大量結(jié)合了捕捉探針的磁球在雜交緩沖溶液中反應(yīng)，讓目標(biāo)DNA分子通過雜交反應(yīng)結(jié)合到磁球上。由于結(jié)合了捕捉探針磁球的濃度大大地大于目標(biāo)DNA分子的濃度，所以只有一個目標(biāo)DNA分子可以結(jié)合到磁球上。第二步取一定量鏈霉親和素修飾的9.95 μm的

14、微球與過量的生物素化的檢測探針反應(yīng)，離心，清洗除去過量的檢測探針。用生物素封閉微球表面未反應(yīng)的鏈霉親和素位點，離心，清洗除去過量的生物素，得到結(jié)合了檢測探針的微球。第三步將上述兩步反應(yīng)的產(chǎn)物按一定比例混合，進(jìn)行雜交反應(yīng)，讓結(jié)合在磁球上的目標(biāo)DNA分子通過雜交反應(yīng)結(jié)合到微球上。因為在這個比例下結(jié)合了檢測探針微球的濃度大大地大于結(jié)合了目標(biāo)DNA磁球的濃度，所以只有一個結(jié)合了單個目標(biāo)DNA分子的磁球可以結(jié)合到微球上。溶液中還有大量未結(jié)合目標(biāo)D

15、NA分子的磁球及未結(jié)合目標(biāo)DNA分子的微球。用磁分離除去未反應(yīng)的微球。此時的溶液中僅有未結(jié)合目標(biāo)DNA的磁球和結(jié)合了單個目標(biāo)DNA分子的磁球/微球復(fù)合體。由于結(jié)合了將此溶液清洗后滴加在載玻片上，用倒置顯微鏡以×10或x20倍物鏡用CCD照像或×100或×200倍用眼觀察。由于未結(jié)合目標(biāo)DNA的磁球僅有0.35μm，在顯微鏡下看不到。而連接目標(biāo)DNA分子的磁球/微球復(fù)合體中微球的直徑為9.95μm，很容易觀察到。這樣就實現(xiàn)了單個目標(biāo)DNA